原创 內皮細胞

內皮細胞有以下幾項生理特點：內皮細胞於培養狀況下會形成如碎石般緻密之單層狀況（cobble stone like monolayer），與其於血管壁上之型態頗為相似，並保留了大部在生物體內之生理特性，包括對物質之選擇性滲透調控以及極緩慢之複製週期。內皮細胞於 正常狀況下複製速度極為緩慢，基本上是處於一種最終級分化之穩定狀態，以放射線標定之胸腺嘧啶攝取方法測量估計發現，內皮細胞之完全取代複製週期 （turn around time）大約是介於47至23,000天不等^（9），可見其穩定性之一斑。由於血管組織之結構過於複雜，培養之內皮細胞成為極佳的血管生理研究替代工具。

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。

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研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：

1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

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上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

??? 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。

??? 以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫? 1981）

??? 1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。

??? 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。

??? 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

??? 4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

??? 5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。

??? 6、反复吹打，制成悬液。

??? 7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

??? 8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO₂温箱培养