原创 循环肿瘤细胞的检测方法（二）

1.2 物理特性富集法

物理特性富集法根据物理性质来分离CTC，包括大小、密度、力学和介电性质。从大小上来看，CTC的直径约为10-20μm，而血细胞大小为7-12μm，通过过滤可留下体积较大的CTC。从密度上来看，CTC的密度较白细胞和红细胞密度小，通过密度梯度离心可实现CTC分离。除了大小和密度的差异，一些技术也利用CTC和血细胞之间的力学和介电性质差异来捕获CTC。具体来说，CTC的可变形性不及血细胞。另外，CTC的膜电容通常较血细胞低，在一定强度的电场中，其迁移率与血细胞会产生差异。微流控技术除了在亲和性富集法中有广泛应用外，在物理特性富集法中也有应用。微流控芯片根据CTC与血细胞物理特性的差异，通过在芯片中设置不同的微结构单元将其从血液中分离出来，常用的微结构包括微孔、微过滤网和微柱等。

1.3 生化和物理特性相结合的方法

此外，也有一些技术将CTC的物理和生物化学特性结合起来用于CTC富集。如CTC-iChip，其基于CTC大小和表面标志物的表达情况进行CTC富集。该技术首先根据细胞大小，将较小的红细胞和血小板过滤出去，留下白细胞和肿瘤细胞。然后，用识别EpCAM的磁珠偶联抗体对CTC进行免疫染色，在磁场中捕获并收集在芯片上。或者用识别CD45的磁珠偶联抗体去除白细胞后收集CTC。

生化和物理特性相结合的富集法（以CTC-iChip为例）

二CTC富集技术的发展历程和趋势

2.1 发展历程

从技术发展史来看，CTC富集技术分为三代：第一代为基于物理特性的粗分离技术，第二代为基于生化特性的免疫磁珠技术，第三代为基于物理或生化特性的微流控芯片技术。

2.1.1 基于物理特性的粗分离技术

基于物理特性的粗分离技术通过特殊滤膜装置、密度梯度离心将CTC分离出来。这些技术操作简单成本低廉，不依赖细胞表面抗原的表达，捕获的细胞数量多，但是由于CTC物理特性的异质性，难以富集到高纯度的CTC。

基于物理特性的粗分离技术

2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技术

基于生化特性的免疫磁珠技术通过免疫磁珠偶联的抗体或多肽正向或负向筛选出CTC。由于技术的限制，早期的磁珠只能达到微米级。随着纳米技术的发展，现在使用的磁珠大都为纳米级，其增大的比表面积增加了与待测细胞的接触几率，更好的分散性降低了对细胞造成的机械性压力，大大提高了CTC的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC的技术平台是强生子公司veridex的CellSearch，其是全球目前唯一同时经过FDA和CFDA批准的用于CTC检测的商业化产品。该产品由于检测灵敏度不高，且无法分离活体CTC，2016年初已停产。除了CellSearch之外，也有多种技术平台基于免疫磁珠技术捕获CTC，如AdnaGen公司（已被Qiagen收购）的AdnaTest，Miltenyi公司的MACS，Illumina公司的MagSweeper。

用于CTC检测的CellSearch平台。（A）将血液吸入含有EDTA和细胞保护剂的CellSave保护管中;（B）将7.5mL血液转移到单独的管中并离心以分离固体血液成分和血浆;（C）样品放入CELLTRACKS?AUTOPREP? 系统中，吸出血浆并将样品重悬于缓冲液中;（D）添加偶联EpCAM抗体的磁性纳米颗粒并与EpCAM阳性细胞结合，从而“富集”上皮来源的CTC。然后将磁珠结合的细胞与其他细胞通过磁性分离;（E）CTC用CK8，CK18和CK19抗体染色。CD45阳性染色细胞被认为是白细胞，并被排除在分析之外;（F）应用DAPI染色细胞核;（G）施加磁力以分离磁珠结合的EpCAM阳性细胞;（H）CK阳性、DAPI阳性、CD45阴性的细胞被认为是CTC用于进一步分析。

2.1.3 微流控芯片技术

微流控芯片技术基于CTC的物理特性或生化特性或两种特性的结合来富集CTC，所需样品量小、流速可控而且能够捕获活细胞。微流控芯片技术目前已经历了三代的发展过程：第一代芯片为以CTC-Chip为代表，第二代芯片以HB-Chip为代表，第三代芯片以CTC-iChip为代表。

微流微柱富集：该类芯片基于CTC与血细胞生化特性的差异，在芯片中设置微柱阵列将其从血液中分离出来。此类芯片以CTC-Chip为代表，该芯片是第一个使用微流体技术富集CTC的装置。CTC-Chip由78,000个微柱阵列组成，微柱被识别EpCAM的抗体包被，微柱的几何排列和流体流速被优化以促进细胞附着到抗体包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司开发基于微柱结构的芯片富集CTC，如Captura公司的GEDI-Chip，Biocept公司的OncoCEE。基于微柱结构的芯片由于复杂的微柱设计很难在大规模的基础上进行高通量生产。此外，目前用于CTC检测和表征的技术严重依赖于免疫细胞化学和需要高分辨率成像的其他技术，这在非透明三维微柱阵列的存在下是困难的。

第一代芯片CTC-Chip

微流表面富集：由于基于微柱结构的芯片的局限性，表面捕获的微流体芯片被开发，这些芯片使用抗体包被的表面装置捕获CTC。表面捕获装置的简化架构更适合于大规模生产，并且还允许制造更易于成像的透明装置。此类芯片以HB-Chip为代表，其微流道的结构为鱼骨形（HB），表面被识别EpCAM的抗体包被，血液流过一个可视通道，通道内鱼骨形沟回能够引起血液的一个轻微斡旋，从而增强了其与抗体修饰表面的接触。与第一代CTC芯片相比，第二代的HB芯片制作更为简单，且可更高效地捕获肿瘤细胞，捕获效率约90%。后人在第二代的基础上加上了aptamer（结合CTC表面的EpCAM），进一步提高了CTC的捕获效率。除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidal Microsystem也都采用表面装置捕获CTC。使用表面捕获装置的一个挑战是下游处理的灵活性，捕获的CTC被固定在装置的表面上，并且难以恢复以进行进一步分析。在胰蛋白酶消化后可以释放在这些装置中捕获的细胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后续分析的许多感兴趣的表面受体。

第二代芯片HB-Chip

微流免疫磁珠富集：目前已经有多家公司或研究单位应用免疫磁珠技术来解决表面捕获装置的局限性，该技术能很好地控制细胞捕获与释放。此类芯片以CTC-iChip为代表，该芯片将免疫磁珠和微流控技术结合起来用于CTC富集。CTC-iChip首先使用塑料微柱阵列将小个的红细胞和血小板过滤出去，然后在磁场中通过“惯性聚焦”作用将较大的细胞排成一行，并使用阳性或阴性富集方法分离CTC与白细胞。CTC-iChip的捕获效率可以高达98%，但是对于直径较小（<8微米）的CTC并不适用。除了CTC-iChip，也有多种芯片技术使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，Fluxion公司的Isoflux，这些芯片的捕获效率与第二代芯片相近，为90%左右。

上述芯片主要基于CTC的生化特性将其从血液中分离出来，具有特异性高的优点，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞。目前大部分技术采用EpCAM作为CTC的表面特异性抗原，但是在不同的肿瘤亚型中，EpCAM的表达各不相同。依赖EpCAM的CTC分选芯片会丢失不表达或低表达EpCAM的CTC，然而这些CTC具有更大的浸润性和侵入性。因此，缺乏公认的表面标志物限制了亲和性富集在CTC分选中的应用。

为了无需依赖表面标志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于细胞大小和变形性差异的芯片技术，基于细胞力学性质的芯片技术和基于细胞介电性质的双向电泳技术。

基于细胞大小和变形性差异的芯片技术：该技术通过在芯片内部设计不同的小于CTC直径的微孔、微过滤网、微柱等结构，当含有CTC的样品流经芯片时，CTC由于直径大而被卡在结构内，血细胞则随缓冲液一起流出，较大的白细胞被结构捕获时，由于CTC比白细胞变形性小，加大缓冲液流速时，白细胞被冲走，CTC则留在芯片内，从而达到分离目的。Abnova公司的ClearCell?CXSystem就是基于此原理分离CTC的代表，该系统还可以动态监测CTC的捕获过程。芯片主要结构由圆柱形微柱构成，每个捕获单元由三个圆柱排列组成一个“爪形”结构。

基于细胞大小和变形性差异分选CTC的优势在于：操作过程简单，捕获效率高，能够实现高通量富集，成本远远低于CellSearch，无需依赖表面标志物，分选出的CTC可以用多种抗体进行标志物鉴别。该方法存在的问题是仅仅基于细胞尺寸和变形性不同而进行过滤式分选，由于CTC尺寸和白细胞有重叠部分，CTC有可能会通过滤网或微柱的间隔；而且在较大的机械力作用下，CTC随着缓冲液流过微柱或者滤网时容易破裂。这些因素会对分离纯度和细胞活性造成一定影响，这类芯片在设计内部捕获单元时应避免使用带棱角的微柱，比如三角形、长方形、正方形等。

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