原创 基于微流控平台的单细胞通讯研究进展

异质细胞间通信对于多细胞生物体调节许多生物过程具有重要的作用，包括发育、分化和免疫调节等。此外，它们还与多种疾病的发生发展密切相关，如癌症、自身免疫性疾病和血栓。了解异质细胞间通讯对于揭示许多生理和病理过程机制至关重要，并将有利于新药的开发。体外细胞共培养是研究细胞间通讯的常用方法，通过将不同类型的细胞共同培养，检查不同细胞群之间的相互作用。然而，传统的共培养方法依赖于细胞群，因此只能给出细胞群水平的平均化结果。近年来，基于微流控平台的单细胞共培养已成为一种新颖的培养技术。它使用合理设计的微流控平台将不同类型的单细胞共同捕获和培养，可以在单细胞水平揭示不同类型细胞之间的相互作用，并可能揭示一些生理和病理过程的未知机制。

近期，中山大学周建华教授、黄璐助理教授和广州医科大学陈寅副教授在Cell Reports Physical Science期刊上发表了题为“Interrogation of single-cell communications on microfluidic platforms”的长篇综述文章，全面介绍了基于微流控平台的单细胞通讯研究进展，讨论了当前技术的优缺点，并总结了该领域的机遇和挑战。黄璐助理教授为该文章的第一作者，陈寅副教授和周建华教授为通讯作者。

两种异质细胞的共培养

探索两个异质细胞之间的通信是揭示多细胞生物中更复杂的相互作用的第一步。为此，需要可以配对异质单细胞的共培养系统，用于在密闭空间中建立单细胞对。单细胞配对是实现单细胞通讯研究的最关键和最具挑战性的一步。常见的单细胞配对策略可分为两类：随机性配对和确定性配对。对于基于随机方法的微流控平台，由于异质单细胞通常以随机方式共捕获，因此配对率服从泊松分布并且相对较低。相反，确定性配对方法以可控方式共捕获细胞，从而可以大大提高配对效率。

虽然极低的配对率是随机配对方法的常见问题，但由于这些方法简单易操作，许多研究人员开发了随机单细胞配对平台。根据设计的微观结构，这些平台可以进一步分为三大类，分别为基于微孔、基于流体动力陷阱和基于微滴的随机细胞配对（图1）。

图1 用于两个异质单细胞共培养的随机细胞配对

低配对效率和可重复性是随机单细胞配对策略的固有缺点，严重限制了其进一步的应用。为了解决这些问题，许多旨在实现单细胞可控配对的新方法被提出，这些方法被归类为确定性细胞配对。利用该方法，异质单细胞以可预测和可重复的方式配对，从而大大提高了细胞配对效率。确定性细胞配对克服了传统随机方法中出现的泊松分布缺点，可实现高达90%的总捕获率和88.1%的异质细胞配对率。根据所涉及的配对原理，这些单细胞配对平台可进一步分为四种主要类型，分别是基于微孔、流体动力陷阱、微液滴和主动式捕获的确定性细胞配对（图2）。

图2 基于微滴和主动式捕获的确定性细胞配对，用于两个异质单细胞的共培养

多种不同类型单细胞的共培养

不同类型的多个细胞之间的相互作用在生命体生理和病理过程中更为常见。研究多种类型细胞之间的相互作用，对于理解生命活动的规律、揭示疾病的机制和探索它们的治疗方法至关重要。具体来说，在单细胞水平上揭示异质细胞之间的相互作用是实现这些目的的最有效手段。要实现这一点，前提是实现多个不同类型的单细胞的共培养。然而，由于用于多细胞分离及捕获的芯片设计复杂，实现多个异质单细胞的共培养具有挑战性，迄今为止较少有方法被报道。

为保证较高的共捕获率，通常使用确定性方法对多个异质单细胞共同捕获。常用的方法有两类，即：基于微孔和基于流体动力陷阱的确定性细胞共捕获。此外，一些先前描述的单细胞配对方法在多细胞捕获和共培养方面也具有潜力。

图3 在芯片上捕获和共培养多个不同类型的单细胞

当前方法的比较

微流控平台为在单细胞水平上研究细胞间通讯提供了新的途径，具有对单细胞的精确操纵、模拟生理相关的微环境以及在不同条件下进行高通量分析等优点。由于细胞负载的不可控性和统计性质，随机方法表现出较低的共捕获效率。表1总结了一些代表性方法的特征，包括每个芯片的微结构数量、共捕获效率和异型细胞类型。

在基于不同共捕获原理的各种平台中，基于微孔的方法由于没有集成辅助通道或阀门，设计简洁、制造简单、操作方便，且通常无需泵或电源辅助。但是，它通常无法控制细胞的比例和距离。

基于流体动力学陷阱的方法是单细胞捕获和共培养的常用方法，具有高度的灵活性和精确度，可以通过精细调整控制阀和流道的几何形状等优化其性能。然而，由于使用通常占用大空间的辅助结构，每个芯片的培养单元数量通常较低。此外，由于需要连续灌注培养基，参与细胞间通讯的信号分子会被稀释和冲刷到整个芯片上，导致不同培养单元之间的未知偏差和干扰。

基于微液滴的方法将细胞限制在孤立的液滴中，细胞分泌物也被限制在单独的隔室中，避免了相邻细胞对之间的串扰。此外，它可以共包覆具有显著不同大小的异质细胞，被包覆在液滴中的细胞可以自由移动而不受物理限制。然而，它不适合长期的细胞培养，因为液滴中的营养物质通常不能补充。此外，由于贴壁细胞在悬浮状态下容易发生凋亡，不适合贴壁细胞的共培养。

基于主动式捕获的方法具有高度可控和易于自动化的特点。然而，它们通常依赖复杂的外部设备，操作困难。此外，有时它们需要使用对细胞有潜在危害的物质。例如，介电泳装置中使用的非导电介质缺乏必要的营养物质或生物物理特性。磁性方法需要磁性颗粒附着在细胞上，其细胞毒性尚未得到充分研究。

表1 代表性的单细胞共培养微流控平台比较

综上所述，该文章讨论了用于单细胞共培养的各种微流控平台。目前在该领域的研究已取得显著进展，但仍有一些问题需要解决。例如，设计同时具有大培养空间、高通量和无串扰的平台仍然具有挑战性。目前大多数方法都是为两个异质单细胞的共培养而设计的，多种单细胞的共培养方法则不足，且后者通常具有极低的吞吐量，实际应用比较有限。同时，目前大多数方法都是针对非原位表征而构建的，其中靶细胞已经从原始微环境中分离出来，可能导致一些关键生物学线索的丢失。此外，荧光探针和显微成像仍然是最常用的下游表征技术，大多数传统定量分析与微流控平台的兼容性较低，单细胞水平的细胞复杂性无法被完全展示。

但相信，随着微制造技术的进一步改进，将推出结构和功能更精细的单细胞共培养平台。随着与微流控器件兼容的多传感仪器的开发，将有大量更高维数据用于更全面地描述单细胞通信。然而，这些进展可能给高度复杂、异质和多维数据的分析带来挑战。因此，探索处理生成数据的有效方法将是未来发展的重要方向。例如，人工智能辅助的数据处理技术特别适合用于海量的高维数据，它可以有效分析复杂多维数据，协助研究人员挖掘隐藏的信息。新型微流控平台、多传感技术和高效数据分析方法的融合，将有望通过揭示传统批量分析中隐藏的信息，为生物和医学科学领域提供前所未有的洞察力。

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