原创 通过微流控复制剪切介导的蜘蛛丝自组装（上）

开发具有与原生丝相似特性的人造蜘蛛丝一直是材料科学中一项具有挑战性的任务。在这项研究中，我们使用微流控装置来创建基于重组 MaSp2 螺蛋白的连续纤维。该策略结合了离子诱导的液-液相分离、pH 驱动的纤维颤动和剪切依赖性诱导β片形成。我们发现纤维形成需要大约 72 Pa 的阈值剪切应力，并且β片的形成取决于重复序列中聚丙氨酸块的存在。所形成的MaSp2纤维的β片含量（29.2%）与剪切应力要求为111 Pa的天然吊斗铲相当，有趣的是，聚丙氨酸块对液-液相分离和分层结构的影响有限。研究结果为蜘蛛丝剪切诱导结晶及层织关系提供了新的发展思路，对人工纺丝纤维的合理设计具有重要意义。

蜘蛛拉铲丝是一种基于蛋白质的生物聚合物，体现了无与伦比的强度和柔韧性组合，引起了广泛的科学兴趣。在实验室中，已经做出了各种努力，从螺蛋白前体成分中生产合成的吊索丝;然而，复制天然纤维的机械性能仍然是一个艰巨的挑战。这也许不足为奇，因为拉索丝的性能源于其复杂的分层子结构，为了实现这一目标，蜘蛛采用了一种复杂的机制，该机制通过模块化螺旋体结构域中的构象变化来协调，响应精确定时的化学触发，结合在丝腺旋转管道的有限几何形状内产生的物理力.

人造丝纺丝的经典方法通常涉及通过恶劣的变性条件（例如湿纺中的酒精凝固浴）将非天然蛋白质原料转化为纤维材料。然而，最近，人们越来越有兴趣应用仿生技术在生态良性的条件下生产具有类似天然结构和功能的纤维。在这里，重点是复制微妙的生化过程，这些过程协同作用使蚕丝纤维在自然系统中自组装。这些事件包括液-液相分离 （LLPS），这被认为是多种蛋白质纤维预组装的关键步骤，并且在螺旋体中，它通过重复结构域 （RPD） 和 C 末端结构域 （CTD） 进行调节，以响应 kosmotropic 离子的梯度，例如磷酸盐。同时，酸化梯度通过 N 末端结构域 （NTD） 介导螺旋蛋白链的快速端到端多聚化，以及 CTD的去折叠。剪切和伸长流等流变效应也是主要考虑因素，因为它们促进了纺丝管道内螺旋蛋白链的逐渐排列，并启动了广泛的 RPD 从基本无序状态向有序分子间相互作用的转换，从而能够形成分散的β片纳米晶体，从而赋予纤维更高的强度.

微流控技术在结构蛋白的组装中呈现出令人兴奋的前沿，其中复杂的宏观结构可以构建，至少在理论上，通过定制的通道排列和所需的时间顺序以灵活的方式引入相关的生理触发器。事实上，对于人造丝纺纱，基于微流控的方法被认为比更传统的技术具有促进类似天然纤维组装的最大潜力。特别是，旋转管道的受限尺寸和几何形状决定了关键的流动参数，可以在芯片中小型化通道的设计中得到近似。

先前的研究报道了在纺纱人造蜘蛛丝中结合微流体原理。在仿生保真度方面，这些方法包括各种重组螺旋蛋白序列、微流控芯片设计、化学触发成分以及所应用的关键处理步骤的外化。一个值得注意的例子显示，通过在微流控装置中连续引入磷酸根离子和 pH 值降低，使用三域 ADF3 螺旋体形成纤维。然而，至关重要的是，以前的研究没有报道过具有多级纳米级亚结构的纤维的生产，这是天然丝绸自组装的标志。补充表1总结了重组螺旋体微流控纺丝的差异比较。有趣的是，对于再生丝素蛋白（RSF）的纺丝，微流控芯片内部产生的力已被量化，以显示沿通道的剪切和伸长率的分布，揭示了这些力与β片内容物之间的关系。然而，在重组螺旋体的情况下，尚未对微流体通道内的力进行这种定量分析，以将力与纤维的形成和构象的变化联系起来。与RSF相比，天然状态下的重组螺旋体对导致自组装行为的自然发生的触发因素反应更灵敏。因此，量化类天然条件下的剪切应力等力对于更好地理解蜘蛛丝自组装机理具有重要意义和意义。

在这里，我们提出了一个合理设计的微流控系统，旨在通过整合有关体内自组装过程的最新见解来模拟天然丝纺设备的功能。通过连续施用触发相分离和纳米纤维形成的仿生化学梯度，以及通过可量化的剪切效应，我们证明了来自重组 MaSp2 前体的多级结构丝纤维的完整原位组装，具有可调的β片丰度和近乎瞬时的速度。

仿生微流控装置的电子标志

我们旨在设计一种仿生微流控装置，该装置近似通道内的天然化学和物理梯度，用于研究蜘蛛丝纤维组装。该芯片的架构如图1a所示。它包括 3 个入口，即（1）前体螺旋体溶液、（2）中性 pH 下的 kosmotropic 离子和（3）低pH值颤化触发器。该架构提供了两个顺序混合区域，然后是终止于出口的扩展通道，并沿设备定义了三个区域，用于监控自组装的连续阶段（A、B 和 C 部分）。该设计合理化如下：在流动开始时，源自 （1） 和 （2） 的流合并，使螺旋体暴露于类似于蜘蛛纺导管中发现的 kosmotropic 阴离子梯度，预计会触发 MaSp2 的 LLPS，新生的蛋白质液滴通过层流通过 A 部分向下游输送。 随后沿相反方向与源自 （3） 的流接触会产生 pH 梯度， 它模拟了自然酸化效应，并有望触发螺旋体冷凝物凝固成纤维状网络（B 部分）。C部分构成一个尺寸为2 cm×80 μm×62 μm的直通道，预计机械变形会促进延伸丝状纤维的组装。

需要说明的是，我们选择了一种简化的设计，其中每个单独的通道都具有均匀的横截面，并且宽度从B（60μm）增加到C（80μm），以便关注剪切在调节纤维组装和结晶方面的影响，同时最大限度地减少拉伸流的影响。这与天然纺丝管道中发现的更复杂（即收敛）几何形状形成鲜明对比，在自然纺纱管道中，管道朝向喷丝头逐渐变窄会产生强大的拉伸流，有助于丝分子的排列。值得注意的是，我们系统中的样品流是通过从出口施加负压（真空）来启动的，这在以前的丝状纤维组装策略中并不常见，其中流动通常通过正压或注射器泵送技术产生;这是为了模仿天然丝纤维从生物体中“拉出”而不是被“推出”的观察结果（拉挤）;此外，这还能够对微流体装置内产生的力进行微调控制。

从LLPS到纳米纤颤再到纤维形成的类天然丝组装

作为蜘蛛丝构建单元，我们使用了重组 MaSp2 吊索螺旋体，具有一系列结构域结构（图 1b），包括 N-R6-C 和 N-R12-C 的完整构建体（分别具有 6 个和 12 个串联重复序列）、截短构建体 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x，以及用交替甘氨酸和丝氨酸残基 （GSGSGSG） 替换聚丙氨酸块的三结构域 N-R12-C（xA） 变体， 评估纤维组装过程中β片形成的顺序依赖性。制备的螺旋体通过SDS-PAGE确认。

在微流体系统之外，通过暴露于中性pH值下的科斯级离子，可以很容易地诱导三域MaSp2形成LLPS液滴（图1c），而在酸性条件（pH 5.5-5.0）下，LLPS和NTD介导的多聚化的联合效应产生了自发和快速的网络组装（图1c）。在这项研究中，我们使用混合柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液 （CPB） 系统作为一般的 kosmotropic 触发因素，因为与单个磷酸盐和柠檬酸盐成分相比，它在相关 pH 值范围 （7.5–5.0） 内的缓冲能力有所提高。

逐步仿生过程被集成到微流控系统中，并优化为以最小的干预生成分层结构的 MaSp2 纤维。该方法本身只需在恒定负压下在入口 3、2 和 1 处依次添加组件，然后立即停止泵。根据经验建立了有效纤维形成的条件，我们将其定义为在微流体通道内产生单个连续纤维，不包括纤维断裂或聚集体或其混合物的形成。在这里，发现纤颤缓冲液的组成至关重要，在浓度在1-1.5 M和pH值为5.0之间时，CPB以及施加压力的大小以及所施加压力的大小都获得了最佳结果。

图2a概述了在−90 kPa压力下，在50 mg/ml（入口1）、50 mM CPB pH 7.0（入口2）和1.0 M CPB pH 5.0（入口3）下使用标记构建体N-R12-C获得的结果。在整个通道长度上可以观察到凝聚的 MaSp2 结构，通过器件的连续阶段，中尺度形态发生了明显的演变。沿着A段，入口1一侧的通道壁上密布着大致呈球形或无定形的MaSp2冷凝物沉积物，具有部分液滴融合和表面润湿特性，与LLPS的形成和蛋白质液滴通过层流向下游迁移一致（图2a-c）。该结果与液滴的动态形成和融合行为一致，如图1c所示。尽管缓冲相和层流触发器之间的表面接触相对有限，但MaSp2能够进行广泛的LLPS，这一事实表明初始条件接近相分离边界，这确保了当两股流接触时迅速相分离。

在B段中，MaSp2凝聚水转变为具有颗粒表面的扁平片状形态，这是由酸化梯度的综合效应引发的突然变化，酸化梯度触发了纤维化，以及通道几何形状变化引起的剪切效应。除了B部分形态的明显变化外，螺旋体的相应结构还受到该纤维化阶段引入的化学和物理触发因素的影响（见下文）。再往下游，在C部分，我们看到在整个通道长度上形成了连续的不间断纤维，圆直径为5-10μm。在这里，纤维的分层子结构非常明显，由沿纵轴取向的密集堆积的纳米原纤维组成（图2d，e;补充电影 2），验证了仿生自组装策略。实际上，在设备C部分中形成的对齐纳米纤维束可以被认为是类似于在pH 5下将MaSp2与CPB混合时在设备外部组装随机蛋白质网络结构（图1c），由通道内的定向流动提供原纤维排列的额外因素;换句话说，在蛋白质网络单轴取向后，2D网络结构可以转化为1D纳米纤维。形成后，可以从设备中回收纤维以进行进一步分析。值得注意的是，纤维能够在纯水中保持结构完整性并表现出高柔韧性（图2f）。在一些局部区域，整体纤维结构确实破裂了，这清楚地揭示了一个由具有高纵横比的单个蛋白质原纤维组成的底层亚结构，并沿纤维的纵轴取向图2g。在补充电影 3 中展示了构建体 N-R12-C 纤维组装后微流控装置的整个长度的可视化，这提供了分层组织的进一步证据。

有趣的是，虽然完整的结构（即 N-R6-C 和 N-R12-C）产生了具有微观下无法区分形态的纤维，但截短的变体 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x 在相同条件下未能产生任何纤维，这强调了不同结构域之间在天然条件下成功自组装蜘蛛丝的关键相互作用。此外，虽然缺乏聚丙氨酸块的三结构域N-R12-C（xA）在A和B段中表现出与N-R6-C和N-R12-C结构相似的形态，但C段产生的纤维结构经常在通道内破裂，反映了这些结构的明显力学弱点。

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