原创微流控粒子分选中圆形微凹槽容纳特性研究

 2024-3-13 14:39  375 3 3 分类: 医疗电子

摘要：微流控技术（Microfluidics）为粒子和细胞操控提供了新平台。基于粒子惯性迁移和微凹槽涡胞捕获的粒子分选方法，成为一种重要的微流控粒子操控技术。目前，微凹槽容纳的捕获粒子数量不高，制约了该方法的效率。为提高微凹槽粒子容量，对圆形微凹槽进行结构设计，并利用高速显微成像技术和数值模拟，研究了不同圆形微凹槽的粒子容纳能力。研究发现，相同入口雷诺数（Re = 37~555）下，带底腔的圆形微凹槽相较于普通圆形微凹槽容纳的粒子数量提升了 45%；当 Re = 444 时，带底腔的直径 500 μm 的圆凹槽比直径 600 μm 的圆凹槽的粒子容量提高了 54.7%，原因是前者凹槽内内粒子运动轨道与流线更加吻合，粒子轨道面积与凹槽面积占比达到了97%；从侧通道收集到的 20 μm 粒子的最大富集浓度为初始悬浮液的 126.7 倍。研究结果对微凹槽结构设计、提高粒子分选性能有重要指导意义。

在细胞分析检测中，从复杂的细胞溶液中对目标细胞进行分选和富集是至关重要的样本处理步骤。传统方法，如离心[2]和荧光激活细胞分选，是实验室和医院广泛使用的技术之一，但需要庞大、昂贵的仪器，且存在目标细胞污染和丢失。

微流控技术（Microfluidics）是在微米级通道中操控微小体积流体（10-9~ 10-12L）或样本的多学科交叉的新兴研究领域。由于微通道尺寸与细胞尺寸相当，微流控技术在细胞分选操控方面的能力凸显出来，具备高效率、高纯度和低成本等优势，成为粒子和细胞分选的新平台。微流控粒子分选可分为生物方法和物理方法。前者需要对通道壁面进行生物化学修饰，后者基于细胞物理性质差异（尺寸、密度、表面电荷量和变形性等），可再分为主动式和被动式两种。主动式需要外加力场（磁、电、光、声等），被动式仅通过设计巧妙的通道结构，利用微通道中流体流动来操控粒子运动。其中，惯性微流控技术（Inertial Microfluidics）仅利用微通道中粒子和流体的惯性效应实现分选，成为了被动式物理方法的代表。惯性升力驱动颗粒发生侧向迁移，通过改变通道形状和入口流速等调控颗粒的运动，实现颗粒的迁移聚焦，微通道几何形状包括：弯曲通道、螺旋通道和蛇形通道等。

基于微凹槽涡的粒子分选方法充分利用直通道中粒子惯性迁移和微凹槽内的涡胞流动，可以将含量极低的（10-9）循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs，12~30 μm）从全血细胞中分选出来，且可实现目标粒子的富集，具有结构简单、并行化、效率高、细胞损伤小等优点，成为了一种重要的惯性微流控方法，有望成为实现癌症“液体活检（Liquid Biopsy）”的关键技术。

自Di Carlo 团队首次报道了基于微凹槽涡的粒子分选方法以来，为了提高粒子分选效率，许多研究者对矩形凹槽尺寸、长宽比和入口流速等因素进行了优化研究。Zhou 等对矩形凹槽尺寸、粒子直径及浓度等因素进行了实验和流场仿真，发现随入口雷诺数（Reynolds number，Re）增大（130-330），单个 400×400 μm2 凹槽内粒子数量先增多后减少的现象（最大值<40 个）。Haddadi 等对凹槽尺寸和工况进行了优化，也发现凹槽会达到饱和状态，制约了该方法的分选效率，并改进了凹槽排布方式。此外，Wang 等在矩形凹槽侧面增加了排液通道，实现了目标粒子的连续排出与收集。Volpe 等设计了一种立体式芯片结构，侧通道排出的粒子直接流入下面的收集池。然而，多个凹槽并行时，需要设计更多的出口通道。

目前研究，多关注该方法的技术应用，对微凹槽涡内的粒子轨道运动行为认识尚不深入，需要将其中的微凹槽容纳机理独立出来研究。当凹槽容量饱和时，捕获的目标粒子发生逸出，从而限制了分选性能，阻碍了其临床应用。提高凹槽粒子容量，既可以提高分选效率，又提高了目标粒子富集浓度，有利于进一步的细胞检测。

作者前期研究发现矩形凹槽结构与粒子运动轨道并不吻合，并首次采用圆形微凹槽进行粒子分选实验，发现圆形凹槽结构与粒子轨道更加吻合，粒子数量和浓度分别提高了3~5 倍和 2~4 倍。本文进一步对圆形凹槽进行结构优化探索，设计了8 种圆形凹槽结构，并开展了显微高速摄影实验和数值仿真，对比研究了不同凹槽几何因素和 Re 对粒子容量影响，并结合粒子运动轨道和流场仿真初步探讨了圆凹槽粒子容纳机理。

1 实验材料和方法

1.1 微流控芯片

微流控芯片由主通道和三个不同形状的圆凹槽（Cavity I、II、III）组成，如图 1 所示。主通道宽度为 W=80 μm，深度为 H=100 μm。凹槽入口宽度均为 Lc=400 μm，凹槽 I、II 的圆形区域直径为 D=500μm，而凹槽 III 为 D=600 μm，以研究圆凹槽尺寸对粒子容量的影响。凹槽 II、III 的下方设计了 400´200μm2 底腔，以研究底腔对容量的影响。凹槽间距为2000 μm，侧方连接出口通道，用于释放捕获的目标粒子。制作微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxanes，PDMS），模具由标准光刻蚀技术制作。前人研究中为了使粒子惯性聚焦到直通道两侧平衡位置，宽度一般设置为 60-80μm。由于尺寸较小的微凹槽的空间有限，容纳的目标粒子少，而较大的凹槽形成涡流的临界 Re较高，导致切应力升高，对细胞产生损伤，故实验中的凹槽直径为 500 μm 和 600 μm 两种。

图1 圆形微凹槽芯片结构示意图

1.2 实验系统

实验中，在去离子水中加入聚苯乙烯小球模拟真实稀释的血液，同时加入表面活性剂Tween20以防止粒子发生团聚或粘附于通道壁面。目前研究中常采用粒子代替真实 CTCs 细胞，开展机理研究，为细胞分选应用提供理论指导。实验过程中，首先关闭粒子释放出口，然后用注射泵将注射器中的混合液从主通道入口 Inlet注入，流量 Q 为 0.8~2.2 mL/min。粒子经过凹槽捕获后，剩余混合液从主通道出口 Outlet 流出。当凹槽容纳的目标粒子数量饱和后，并打开出口通道，收集得到高浓度的目标粒子溶液。

高速显微成像系统由倒置显微镜、高速摄像机和数据采集系统组成，如图2 所示。对凹槽内捕获的目标粒子运动进行观测和记录，视频分辨率为832×600 像素，帧率为 10KHz。采用 Matlab和 ImageJ软件对粒子图像进行处理，得到粒子运动轨迹和叠加图像等。实验在 25 ℃的室温下进行。

1.3 数值仿真

利用ANSYS-Fluent（V19.0）进行微凹槽流场特性数值模拟，主要过程包括：模型建立、网格划分、网格优化及独立性验证、边界及条件设置、运算求解和结果后处理分析等。首先，通过建模软件SolidWorks 建立微通道流域三维模型，如图 3（a）所示，包括 4 组凹槽结构。由于粒子分选捕获过程中侧通道出口是关闭的，故建模时简化掉了侧通道。然后，通过 Hypermesh 软件进行模型的网格划分，采用非结构化四面体网格。最后，采用去离子水作为工作流体，设置流量入口（Q）和压力出口大气压（Patm）条件，壁面均采用无滑移边界条件，选择层流模型，采用SIMPLE 算法来求解速度场和压力场耦合的问题，求解控制方程，收敛精度为 10-5。为提高计算准确性，进行了网格优化和独立性验证。提取了不同网格数量模型直径 500 μm 圆形凹槽中心处 y 方向的速度分布，如图 3（b）所示。由图可知，当网格量大于 72642 时，速度基本不再变化，计算结果与网格数量无关。

1.4 微凹槽粒子容纳机理

微流控系统中流体一般处于层流或斯托克斯流（Stokes flow）状态（Re→0），但高通量时，中部范围流动（Intermediate flow）状态（~1 100 的流动均出现在微通道内，此时流体惯性作用不可忽略，Re、界面张力和粘度等参数对流场和粒子运动产生重要影响。粒子流动可通过微通道雷诺数 Re 和粒子雷诺数 Rep 表征：

刚性颗粒在受限直通道泊肃叶流中运动受到四个横向升力作用：由于滑移-自旋效应的马格努斯升力、由于滑移-剪切效应的萨夫曼升力、壁面诱导升力和剪切梯度升力。其中，马格努斯升力和萨夫曼升力通常非常小，可以忽略不计。剪切梯度升力（FLS）和壁面诱导升力（FLW）是颗粒横向迁移的主要影响因素，前者引导粒子向通道壁面移动，后者排斥粒子向通道中心线移动。

凹槽粒子分选过程分三个步骤，如图4 所示：（i）直通道粒子惯性聚焦：在 FLS 和 FLW 的作用下，大小粒子发生惯性迁移，聚焦到通道侧壁面附近的平衡位置；（ii）凹槽入口区域粒子横向迁移：FLW降低，FLS 主导粒子向凹槽底部迁移，迁移速度与粒径成正比；（iii）微凹槽涡内粒子轨道循环运动：被捕获的目标粒子在凹槽内随涡胞做周期性轨道循环运动，对凹槽粒子容量有重要影响。