标签: 体外细胞培养

一、体外细胞培养 体外细胞培养平台对现代研究、临床研究和药物开发至关重要。一个多世纪以来，培养皿一直是体外细胞培养的基石。这项技术的发明者朱利叶斯·理查德·佩特里打算将其用于微生物培养。时间证明了它在生物医学领域的广泛性与有用性。一个多世纪以来，这些器件已经被制作成了大量的材料设备，并成为了生物学领域的突破性研究。 然而，随着科学的不断进步，人们发现培养皿并不能完全还原体内生物的真实情况。换句话说，培养皿无法重现体内细胞的生理环境。 当在塑料或玻璃板上培养细胞时，我们忽略了体内细胞微环境所带来的诸多刺激，而这些刺激却极大地影响着细胞在人体内的行为与作用。西班牙哲学家奥尔特加·加塞特曾说过：“我是我自己和我周围的环境”。无独有偶，细胞生物学同样认为，“细胞就是它们自己和它们的微环境”。如果不能正确地重建这种微环境，我们在研究时，将完全歪曲体内细胞的整体行为。 这一思路使全球的工程师和生物学家开始致力于开发新一代细胞培养平台，以满足再现细胞微环境这尚未实现的需求。 在这些新的细胞培养平台中，其中最有前途的是微流控设备。 二、微流体学 微流体学是一门研究微尺度流体操作的科学，其方法是将流体流动限制在 10-6-10-3m 尺寸的通道中。这些应用于细胞培养的平台被称为 “芯片上的器官” ，允许细胞接受类似体内的机械、电气和化学刺激。 Beonchip则致力于这些平台的设计、开发和商业化。我们多元化的学科团队，其中包括生物学家、工程师和物理学家，每天都致力于开发新的细胞培养平台和模型，以充分还原生物生命过程，并产生比经典体外模型更可靠的结果。我们的最终目标是通过新一代药物研发体外平台的创建和新临床生物标志物的鉴定，减少药物研发和毒性试验中对动物的使用，并加快疫苗研发进程。此外，减少动物研究而支持体外研究可以节省研究人员和制药公司研发的时间和成本。 三、芯片上器官技术如何再现人体的生理环境？ 1.首先，在流体通道中使用微通道和分隔室，可以使相关物质和特定蛋白质有组织地进行沉积，从而模拟出细胞外基质。这使得细胞能够像在体内一样进行粘附和相互作用。 2.其次，我们所研究的特定组织将连接一个介质流，这个介质流类似于流经毛细血管的血流，可以灌溉生物组织。这种流动会对特定组织产生物理压力（剪切应力），进而直接影响细胞的表达形态。 3.此外，这种流动也会由于氧气和营养梯度的产生间接导致细胞迁移与分化。芯片上器官技术的最大优势之一是可以通过添加药物、免疫系统细胞、病毒、细菌等其他微生物，将微生物组复制到芯片灌注的介质中。 因此，将不同类型的细胞组合在一个类似体内的结构中，并引入这个组织在体内所受到的所有物理和化学刺激，我们就可以重建器官或组织的一部分，来构建一个功能单元。 这些功能单元可以相互连接来模拟出体内不同器官的串扰，因此可以研究这个相互连接的系统里所产生的各种复杂生化反应，这个概念则被称为体芯片。值得一提的是，美国怀斯研究所的研究人员开发了这项技术的一个例子，他们将芯片上的肠道与肝脏和肾脏连接起来，以评估口服某个药物的效果。在肠壁吸收后，该药物通过模拟的循环系统被运输到肝脏进行代谢，最后到达肾脏排出体外。 从长远来看，这项技术将用于 个性化医疗服务 。即从患者身上提取出细胞并培养在芯片中，在体外复制患者的疾病。这种复制品将允许医生和生物学家测试不同的药物和治疗方法，以观察哪种疗法最适合不同的病人。 我们在Beonchip的目标是随着芯片器官技术的发展，实现本文提到的所有目标，在我们内部研发团队的帮助下，密切帮助我们的客户采用新一代细胞培养平台。我们将继续致力于开发这些创新平台，为更高效、更具伦理道德的生物医学研究领域铺平道路。 四、微流控设备-芯片上皮肤模型示意图 (详细案例及原理见 ： https://beonchip.com/product/be-transflow-standard-10-devices-per-box/ ) 上图显示了 如何在微流控设备中重建芯片上皮肤模型 的示例。该装置可以通过多孔膜将培养井与微流控通道连接起来，从而研究复杂的培养结构。在这个装置中，可以重建灌溉皮肤组织的血管，覆盖分离通道的膜，并与内皮细胞很好地进行结合。真皮主要由胶原和成纤维细胞组成，利用水凝胶中成纤维细胞的三维培养进行模拟。在水凝胶聚合后，我们可以在气液界面培养一层角化细胞。这种培养条件有利于不同层系的外延生长。 原文链接： https://beonchip.com/organ-on-a-chip-101 作者： Sandra Gonzalez Lana and Luis Serrano 参考文献： 1. Herland, A. et al. Quantitative prediction of human pharmacokinetic responses to drugs via fluidically coupled vascularized organ chips. Biomed. Eng. 4, 421–436 (2020). 2. Altas de histología. Facultad de Medicina. Universidad de Zaragoza. http://wzar.unizar.es/acad/histologia/

西班牙萨拉戈萨大学科学家首次采用BE-Gradient微流控芯片观测多球细胞的化学迁移情况，主要研究了OSC-19多球细胞（OSC-19：人舌鳞癌细胞）在FBS（胎牛血清）的趋化反应。探究方向如下：1、通过横向微通道探究不同化合梯度条件下的趋动行为。2、对比OSC-19多细胞在微流控系统（胶原包被）和在孔板中的球状体迁移情况。3、证明了在对趋化梯度的反应中OSC-19单细胞培养时与多细胞球体培养时表现出不同的响应机制。 前言 趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化作用在许多病症中起着关键作用，包括炎症和自身免疫性疾病以及癌症，还有许多发育和组织重塑过程，包括胚胎生长和伤口愈合。因此，能够详细研究趋化过程的技术是药物发现和基础生物学的重要工具。 一、瓶颈挑战 许多不同的方案被用来研究细胞迁移和趋化作用。Boyden Chamber Assay：Boyden小室法是目前细胞迁移和侵袭实验技术最常用的方法之一。虽然这种方法用途广泛，但它有一些局限性：例如，它不能直接观察迁移过程中的细胞。除此之外，还有一些研究细胞迁移和趋化作用其他物质或方法，包括under-agarose凝胶、Agarose Spot、Zigmond chamber、Dunn chamber和Insall chamber检测等。这些检测方法各有其优点，但 它们通常都不能研究随着时间变化的化学梯度对细胞的影响。 此外，梯度控制和重现性可能是一个挑战。这些缺点都可以通过使用微流控系统来克服，微流控系统已经成为研究趋化性的有力工具。 虽然现有技术观察单细胞的趋化反应装置是非常有效，例如Jeon NL的预混器梯度发生器，但它们在某种程度上与更现实的细胞迁移情况有距离。细胞是多细胞系统的一部分， 往往多细胞的趋化反应与单细胞展现不一样的迁移机制。 研究表明，固体肿瘤细胞可表现出与单个细胞不同的机制进行迁移和入侵。例如，胶质瘤为可孤立的侵袭性肿瘤，而上皮细胞似乎是通过集体运动侵袭。 这就跟现实情况造成了一定的差异。更重要的是， 现有技术往往都不允许对多细胞的集体迁移，这是一块研究的空白。 二、解决方案 同时，本文采用BE-Gradient微流控芯片作为核心装置进行研究。该装置由一个中央室（模拟细胞培养）和两条包含3个通向中心室的横向通道（模拟血管）组成。在中心室容纳包含细胞的水凝胶，两侧通过灌注不同浓度的介质，通过水凝胶多孔结构对流体的阻力作用，在横向微通道形成不同的浓度梯度。 BE-Gradient微流控芯片内部结构和参数示意图 三、BE-Gradient微流控芯片中的荧光成像和显微成像表现 在FBS化学梯度下OSC-19多细胞的显微形貌图 在FBS化学梯度下OSC-19多细胞的荧光成像图 （a）OSC-19单细胞的显微图（b）OSC-19单细胞的趋化运动分析（c）OSC-19单细胞的荧光成像图 注：本文图片部分摘引于文献： Ayuso J M , Ba Sheer H A , Rosa M , et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device . Plos One, 2015, 10(10):e0139515. 四、其他应用 3D细胞培养：首先将细胞混合在液相水凝胶中，然后将它们引流至中央室中。水凝胶聚合完成后，通过横向通道灌注具有不同浓度化合物的培养基，并实时监测效果。 2D细胞培养：适用于贴壁细胞，不仅可以在中央室中检测，也可以在横向通道中培养。 应用案例：细胞/球状体入侵和迁移、血管新生、转移、血管生成、趋化、缺血、细胞分化或氧化压力、微型器件内的坏死核心生成、葡萄糖梯度实验。

胶质母细胞瘤为一种高度恶性，生长快、病程短的致死肿瘤疾病，它是成人最常见的原发性侵袭性脑肿瘤，每年大约有 12,000名新增病例 。 由于其研究的特殊性，如何在体外模拟更真实的仿生环境一直是临床研究的难点，西班牙萨拉戈萨大学的研究小组成功攻克了这一难题，让我们看看这是怎么做的吧！ 一、研究快速导览 背景： 胶质母细胞瘤（GBM〉是最致命的肿瘤类型之一。在这些肿瘤中，高细胞区被命名为假性细胞区，并被推测为胶质母细胞瘤细胞迁移的波。这些细胞的”波浪”被认为是由肿瘤引起的血管闭塞所造成的氧气和营养物质的消耗所诱发的。虽然这些结构在GBM肿瘤中的普遍存在表明，它们可能在胶质母细胞瘤的扩散和入侵中发挥了重要作用，但在体外重新创造这些结构仍然是一个挑战。 方法： 西班牙萨拉戈萨大学通过采用先进的体外细胞培养装置——BE-Gradient 微流控芯片，模拟了假性细胞区形成的动态过程。将U-251 MG细胞嵌入微流控芯片的胶原水凝胶中，通过控制介质在横向微通道的流动，模仿和控制与这种疾病相关的血管阻塞事件。 结果： 通过使用这个新的系统，证明营养和氧气的缺乏会引发一个强烈的迁移过程，导致体外假紫斑的产生。这些结果验证了假性细胞区的假说，并显示出与缺氧驱动生物学模型的出色一致性。 本研究有效的证明了 BE-Gradient微流控芯片作为先进的体外培养装置，能够很好的模拟在肿瘤演变过程中营养和氧气的化学梯度变化。 二、BE-Gradient的实验效果介绍 下面让我们了解基于BE-Gradient 微流控芯片更多的实验效果。 （1）BE-Gradient 微流控芯片模拟化学梯度变化的可能性展示（方案之一）： 图1 BE-Gradient 微流控芯片模拟营养和氧气的缺乏区域（I）和富集区域(II)的示意图 （2）微流控芯片细胞长期体外存活能力展示： 图2 在9天后，U-251细胞在微流控芯片中的存活显示，活细胞（用1μg/ml的钙素标记）显示为绿色，死细胞显示为红色（用4μg/ml的碘化丙啶标记）。白色虚线划定了微型装置柱（50x100 µm）。细胞在1.5mg/ml胶原水凝胶内以400万细胞/ml的速度培养 （3）假性细胞区形成的动态过程展示： 图3 在限定条件下形成假性细胞区过程 将400万cells/ml的U-251置于1.5mg/ml的胶原水凝胶中，在微型装置内培养。在不受限制的条件下，每天更换一次培养基，并在3天（A）、6天（B）和9天（C）使用钙黄素（绿色）和碘化丙啶（红色）评估细胞的活力。为了模拟受阻的情况，只让介质通过右侧微通道流动，并在3（D）、6（E）和9（F）天评估细胞活力。白色虚线划定了微装置柱（50x100 µm）的界限。图表显示了在3天（G）、6天（H）和9天（I），在受阻和不受阻的情况下，整个微室正交视图的荧光强度。图中的边界位置由灰色虚线划定。比例尺为200μm。 图4 假性细胞区形成期间的细胞形状 在不受限制（A）或受阻（B）的条件下培养5天后，拍摄微室的共聚焦图像。(C)分析了假性细胞区后部和前部的细胞形状，并与无限制条件下的同一区域进行比较；。(D) 在受阻条件下，假性细胞区后部的方向性。(E) 石蜡包埋的GBM样本的苏木精和伊红染色。(F) 患者样本中假顶点后部和前部的细胞核长宽比；比例尺为200µm。 参考文献： Jose, et al. “Glioblastoma on a microfluidic chip: Generating pseudopalisades and enhancing aggressiveness through blood vessel obstruction events.” Neuro Oncology (2017). 三、Be-Gradient的其他应用 （1）产品介绍： Be-Gradient 由一个中央室（模拟细胞培养）和两条包含 3 个通向中心室的横向通道（模拟血管）组成。用于模仿体外的细胞培养。它可以在化学梯度下进行3D或2D细胞培养。由于其使用的聚合物具有一定的光学透明度，所以可以搭载显微镜、荧光显微镜和共焦显微镜辅助观测。 3D 细胞培养：首先将细胞混合在液相水凝胶中，然后将它们引流至中央室中。水凝胶聚合完成后，通过横向通道灌注具有不同浓度化合物的培养基，并实时监测效果。 2D 细胞培养：适用于贴壁细胞，不仅可以在中央室中检测，也可以在横向通道中培养。 （2）应用领域： 细胞/球状体入侵和迁移、血管新生、转移、血管生成、趋化、缺血、细胞分化或氧化压力、微型器件内的坏死核心生成、葡萄糖梯度实验。