标签: 生物芯片

Part.01 点成小科普 液滴生成，是一种在具备某种几何形状的微流控芯片中使用微流控泵精确控制不混溶的液体来生成液滴的技术。液滴的应用范围十分广泛，如生物分子合成、药物发现与诊断、化学反应和DNA测序及扩增等。在制药、化妆品和食品等行业中也有液滴的身影。 Part.02 液滴生成原理 利用点成生物液滴生成解决方案来生成液滴的示意图如图所示。 利用2个ExiGo注射泵或1个四通道的4U压力泵对连续相和分散相的流量进行精准控制。同时，2个流量传感器及时主动地反馈油相和水相中的流量控制情况。当通道流速变化时，微流体装置中的流体电容通常会带来不稳定性。因此，拥有带有流量传感器的精确流体泵以限制此类不稳定性对生产体积尺寸一致、频率均匀的稳定液滴很重要。 对于油包水液滴：需要一个疏水通道表面，这可以通过使用DropCoat预填充芯片实现。对于水包油液滴：需要一个亲水通道，cellix的DropChip芯片通道出售时经过预处理，通道表面是亲水的。为了提高液滴稳定性，通常在油中加入表面活性剂稳定油和水相之间的界面。整个系统通过管道将泵和微流控芯片连接起来。 油包水液滴生成原理示意图 对于需要生成具备2个水相的油包水液滴，需要使用4U压力泵的3个通道或使用3个ExiGo注射泵，并搭配3个流量传感器： 具有2个水相的油包水液滴生成原理示意图 在液滴生成频率上，点成Cellix微流控注射泵或压力泵可实现均匀、单分散的稳定液滴的产生。不同流速下实现的液滴频率如下图所示。 通道尺寸为 70μm x 70μm的DropChip中的液滴频率 在液滴生成尺寸上，尺寸主要受通道的几何形状和尺寸影响。不同尺寸的DropChip芯片可用于生成不同体积的液滴，根据DropChip芯片尺寸可实现的液滴尺寸（直径和体积）如下表所示。 液滴发生器接头1和3：流动聚焦，分散相单注入 液滴发生器连接点2 (DG2)：流动聚焦，分散相双注入 Part.03 点成生物解决方案 点成生物液滴生成解决方案套装包括泵、液滴生成芯片、流量传感器、连接管套件、油溶液和芯片预涂液、电源电线等。 标准套件产品如下： 2 x ExiGo注射泵或1 x 4U压力泵+压缩机 2 x 流量传感器 2 x DropChip液滴生成芯片 管套件 油溶液和芯片预涂液 电源及电线 附加的ExiGo泵、流量传感器、油/表面活性剂溶液和预涂液或生物芯片可单独订购，如果您对点成生物液滴生成解决方案感兴趣，欢迎随时与我们联系~ 我们专注于生命科学、温度控制、临床应用、微流控等领域，重点包括水浴、摇床、混匀器、离心机、微流控芯片等产品，致力于生物科技领域产品和解决方案。

一、背景 人体循环系统包含许多不同类型的血管，它们将血细胞、营养物质、氧气、二氧化碳和激素等输送到身体的各个部位。血管也在血栓、炎症、粥样硬化等疾病中起重要作用。随着微流控技术的发展，越来越多的研究者尝试在体外模拟人体血管以进行相关疾病的机制和药物研究。点成VenaFlux平台是Cellix专门针对血管研究提出的一套微流控集成系统，包含Starter、Pro和Elite版本。本文将简要介绍该平台应用于人体血管研究的工作原理及应用领域。 二、点成VenaFlux的工作原理 点成VenaFlux是如何模拟人体血管的呢？ 血液在流动的过程中，血液施加在血管壁的力被称为剪切应力，以力-面积单位（通常为dyne/cm2）表示，不同血管中的剪切应力不同。Vena8 Fluoro+ 和Vena8 Endothelial+ 生物芯片的微通道类似于动脉、静脉和毛细血管，有助于研究者在体外剪切应力下研究血液和凝血因子的作用。 为了模拟体内的生理剪切应力，点成Cellix利用精密的微流体Mirus Evo泵和ExiGo泵以恒定或可变剪切应力将细胞样本或全血输送到Vena8 Fluoro+或Vena8 Endothelial+生物芯片的微通道中。 生物芯片被放置在温度可控的微环境室中以模拟生理条件。这个微环境室位于带有数码相机的倒置显微镜的平台上，显微镜和摄像头进行自动图像/视频采集。 Image Pro Premier是一款细胞分析软件程序，可以分析显微镜和数码相机拍摄的图像。利用这款软件，可以测量出芯片中单个血栓或聚集体的数目、还可以用于分析白细胞滚动速度、粘附与迁移等。以下为部分研究示例： 使用Image Pro Premie分析Vena8 Fluoro+生物芯片的纤维状胶原涂层微管上的血栓形成 使用Image Pro Premier分析THP-1细胞在Vena8 Fluoro+芯片的VCAM涂层微管上的粘附 使用Image Pro Premier分析Vena8 Fluoro+芯片的E-选择素涂层微管上的THP-1细胞滚动速度 三、点成VenaFlux的应用领域 血栓 通常在人体中，当血管受损伤时，为了防止大量出血，血小板和纤维蛋白会形成血凝块。然而有时候即使血管没有受损伤时依然会形成血栓，这引起了研究者对于血栓形成机制及防治的兴趣。血栓的形成是一个多步骤过程：包括血小板粘附、激活和血小板聚集等。要想研究血小板的粘附、聚集和血栓形成，就必须要在剪切流动的条件下进行。 炎症 一般来说，经典的三步白细胞吸附级联包括细胞滚动、细胞粘附和细胞迁移。细胞滚动是选择素介导的滚动，E-选择素识别并以与某些白细胞表面蛋白上存在的受体结合，导致细胞沿着血管的内皮表面滚动。随着炎症反应的进行，受损组织释放的趋化因子进入血管并激活滚动的白细胞，这些白细胞与内皮表面紧密结合，细胞粘附是迁移到炎症组织之前的重要步骤。细胞迁移是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。 动脉粥样硬化 由于斑块（脂肪沉积物）的积聚而导致的动脉变窄，动脉粥样硬化是最常见的心血管疾病之一，可导致包括中风或冠状动脉疾病等许多疾病。 四、点成VenaFlux多版本介绍 点成VenaFlux Starter ：装有VenaFluxAssay软件的PC通过USB连接到Mirus Evo泵。Mirus Evo泵管套件将Mirus Evo泵连接到MultiFlow8，MultiFlow8通过连接管连接到生物芯片。生物芯片放置在显微镜载物台上的微环境室中（VenaFlux Starter不包含显微镜）。 点成VenaFlux Pro ：在Starter配件的基础上，搭配Axio Vert A1显微镜和数码相机，工作程序如下图所示： 点成VenaFlux Elite： 在Starter配件的基础上，搭配Axio Observer7显微镜和数码相机。产品实物图如图：

　　生物芯片是20世纪末随“人类基因组计划”的研究和发展而产生的一项高新技术，是人们高效地大规模获取生物信息的有效手段。目前大部分生物芯片采用荧光染料标记待测样品分子。生物芯片扫描仪用激光激发荧光染料，通过对激发点的成像，检测一个点；结合生物芯片X-Y二维精密扫描台上移动，实现对整片的扫描。 X-Y二维扫描台的位置检测精度直接影响着扫描分辨率——生物芯片扫描仪性能的关键参数。基于传统的数字电路的生物芯片扫描仪中X-Y二维扫描台的位置检测电路存在计数误差和误清零问题，本文以基于FPGA设计的位置检测电路来解决。以FPGA芯片代替传统的数字电路，不仅可提高系统的集成度和可靠性，而且FPGA最高工作频率已超过200MHz，通过硬件描述语言对FPGA编程，电路设计更加灵活，为生物芯片扫描仪进一步提高扫描速度和扫描分辨率留了更大的裕量。 　　 1 X-Y二维扫描台位置检测原理 　　X-Y二维扫描台X向、Y向位置检测元件采用开式光栅，50线/mm,由专用细分尺10细分后，测量分辨为2μm。开式光栅直接利用光电转换原理输出三相方波A、B、Z相。A、B相方波相位差90°（如图1、2所示），Z相用于基准点定位，其逻辑电平都为5V。当A相方波超前B相方波90°时，表示位移方向为正方向，如图1所示；当A相方波滞后B相方波90°时，表示位移方向为反方向，如图2所示。扫描台X向、Y向每位移2μm，光栅发出一个周期的方波。 图1 2 　　因此，X-Y二维扫描台的位置检测首先要解决对光栅信号的辨向问题，辨别出X、Y向的位移方向；其次，为保证生物芯片扫描在最高扫描分辨率为5μm时仍有较高扫描质量，X、Y方向位置检测精度应高于2μm，以减少扫描台的定位误差，因此要对光栅信号进一步细分；此外，还要完成将光栅信号转换成控制器能读取的位置数据，当X向、Y向位移方向为正时，此位置数据递增；当X向、Y向位移方向为负时，此位置数递减，并要保证实时的准确可靠的提供X、Y向的位置数据，作为控制器（如单片机、DSP）精确定位X-Y二维扫描台位置的依据。 　　原有的生物芯片扫描仪中X-Y二维扫描台的一个方向的位置检测采用4倍频专用集成电路QA740210对光栅信号进行辨向、细分，用4片4位二进制74LS193计数器级联实现对细分后的光栅信号16位计数，计数值（即位置数据）通过2片8位74LS245缓冲器输出至控制器。这样，X、Y两个方向的位置检测电路多达14片芯片，占用大量的PCB空间，布线复杂，板上信号间的串扰易引起计数误差和误清零现象，影响扫描台的精确定位。若只用一片FPGA实现位置检测电路，输入为光栅信号，输出即为位置数据，直接送入控制器，避免PCB板间信号串扰，就能有效消除计数误差和误清零现象。 　　 2 X-Y二维扫描台位置检测的FPGA设计方案 　　选用Spartan-II系列FPGA（XC2S15-5VQ100）作为X-Y二维扫描台的位置检测电路，并行的对X、Y两路光栅信号的进行辨向、细分、计数，并提供与控制器的接口，实时可靠的将X、Y向位置数据传送给控制器。 　　FPGA内部模块划分如图3所示：从X向光栅来的A、B两相方波信号XA，XB由X向辨向细分电路辨向细分后，输出两路脉冲信号XCU、XCD，16位计数模块分别对这两路脉冲信号进行计数，并将两计数值XUPCNT、XDOWNCNT相减，其差作为X向的16位位置数据XCNT。接口电路对3位地址信号ADDR译码，通过XCLR、YCLR对X、Y计数器分别清零，并选通X向或Y向位置数据输出到控制器。 图3 　　对Y向同样如此。本论文只以X向说明之。 　　 2.1 辨向细分设计 　　由图1和图2可知，当光栅正向移动时，A相、B相的电平逻辑表现为“00”→“10”→“11”→“01”→“00” 序列；当光栅反向移动时，A相、B相的电平逻辑表现为“00”→“01”→“11”→“10”→“00”序列。因此，只要能辨别出这两种序列，就能实现辨向。 　　引入外部频率为10MHz的时钟源，利用这个时钟的上升沿同时对A相、B相信号采样，作为当前XA、XB值，以二维向量AB_new记之，AB_new通过一级触发器后，记为AB_old， AB_new 和AB_old都跟随A相、B相方波信号变化而变化，只是AB_old要滞后AB_new一个采样时钟周期。这样，就可以将AB_old和AB_new进行比较:当AB_old为“00”时，若AB_new为“10”，即A相超B相前90°，XCU输出一个负脉冲，XCD保持为高电平不变；若AB_new为“01”，即A相滞后B相90°，XCD输出一个负脉冲，XCU保持为高电平不变。X向光栅信号变化一个周期，如果A相超B相90°（位移方向为正），XCU就会输出四个负脉冲，如果A相滞后B相90°（位移方向为负），XCD就会输出四个负脉冲，同时实现了辨向与细分功能。 　 　2.2 可逆计数器设计 　　用两个16位二进制计数器对两路脉冲信号XCU、XCD分别计数，然后用一个16位减法器对此两个计数器的计数值作差，被减数为XCU的计数值XUPCNT，减数为对XCD的计数值XDOWNCNT，其差作为X向的位置数据XCNT。这样， XCU有计数脉冲时，XCNT就会增加，而XCD有计数脉冲时，XCNT就会减小，实现了可逆计数。结合前面的辨向细分电路，使X向的位置数据在正向位移时增加，反向位移时减少。位置数据的变化真实反映了位移情况。 　 　2.3 接口电路设计 　　接口电路是控制器实时可靠读取X向、Y向的位置数据或清零的接口。接口电路由译码电路、输出三态缓冲器组成。接口电路与控制器的16位数据线CNT用于FPGA向控制器传送位置数据，控制器的3位地址线ADDR作为译码电路的输入：能分别输出X、Y向位置数据，以及分别对X、Y向计数器清零。译码电路可使X向、Y向位置数据复用16位数据线，高效的利用控制器的端口资源；对3位地址信号译码产生清零信号，能有效地防止在只使用一根信号线时受干扰等原因而引起的误清零现象。 　　 3 设计仿真和实现 　　在 ISE6.1i 开发平台上，用VHDL语言对辨向细分、计数、接口电路进行编程实现。图4是仿真波形。 图4 　　由图4可看出，X、Y向可并行的对光栅信号辨向、细分、计数，下面只以X向说明：辨向细分电路根据两路正交的方波信号XA、XB的相位差分别在XCU, XCD上输出频率为XA、XB4倍的计数脉冲，实现了辨向细分；可逆计数器分别对XA、XB计数，计数值的差XCNT随X向的位移方向的变化增加或减少；当控制器的地址译码信号ADDR为“101”时， X向的位置数据XCNT输出到16位数据线CNT；当ADDR为“110”时，FPGA将Y向的位置数据YCNT输出到CNT；当地址线ADDR为“001”时，X向位置数据XCNT清零，CNT表现为高阻态；当ADDR为“010”时，Y向位置数据YCNT清零， CNT表现为高阻态；当ADDR为其他任意值时，CNT都表现为高阻态，使控制器能向其他外设交换数据。将代码下载到XC2S15-5VQ100后，用于生物芯片扫描仪中，准确可靠的实现了位置检测功能。 　　 4 结论 　　用FPGA实现X-Y二维扫描台的位置检测电路，提高了系统的集成度，位置检测快速可靠。并且，FPGA工作频率高、设计灵活，可减少生物芯片扫描仪进一步提升扫描速度和扫描分辨率的开发时间和成本。 　　 参考文献 　　1 James R.Armstrong, F.Gail Gray. VHDL Design Representation and Synthesis. Prentice Hall PTR, Inc.2003 　　2 Xilinx DS001 September 3,2003