原创 反相高效液相色谱固定相再生新方法

1   引言

    反相高效液相色谱（RP-HPLC或RPLC）是目前最常用的色谱分离模式。已有的液相色谱分析方法超过90%采用这种模式。在RP-HPLC中，C₁₈、C₈等硅胶基质的直链烷烃键合固定相最为常用，这类固定相在长时间使用后或应用不当的情况下，可能造成填料表面官能团的流失或污染，柱效降低，甚至完全失效。

对性能较差的RPLC柱进行再生处理，尽可能恢复其性能，是一种经济、有效的途径。基于填料变性原因的不同，已有多种色谱柱再生方法。一般说来，如果确认填料表面官能团配基断裂流失，可以将合适的硅烷化试剂通入失效的色谱柱，在一定温度下使之与表面暴露的-OH活性基团反应，让硅烷分子中的烷基重新键合在失效的填料颗粒表面。这种原位重新键合的再生方法仅能恢复部分柱效，且对5μm填料再生后柱压力容易偏高酸碱计| 糖度计| 盐度计| 酸碱度计| 电导计| 水分测定仪| 浊度计| 色度计| 粘度计| 折射计。

如果色谱柱被污染，根据吸附物的性质不同可以选择适当的再生方法。直接进行色谱柱清洗，对于污染不很严重的固定相非常有效。若采用一般的清洗再生方法不能达到理想的效果时，可以考虑将固定相从色谱柱内打出，进行彻底清洗再生后重新装填。本文综合已有的固定相再生方法，发展了一套系统的RPLC固定相再生方法，可以有效提高再生效果。

2   实验部分

2.1 仪器与试剂超声波传感器 同心检查仪 轮廓仪 称重传感器

    P230高压恒流泵；UV230⁺紫外-可见检测器（大连依利特分析仪器有限公司）；色谱柱：250mm×4.6mm i·d，Silica A ODS 5μm和Silica B ODS 5μm。

    N,N’-二甲基甲酰胺；乙酰丙酮；无水乙酸钠（分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心）；丙酮（分析纯，天津市化学试剂三厂）；甲醇（色谱纯，TEDIA）；实验用水由Milli-Q制备。

2.2  实验方法

    通用方法：采用传统的RPLC柱再生方法处理色谱柱，同时可以发展的新方法，即N,N’-二甲基甲酰胺-丙酮依次冲洗色谱柱，并对比两种方法的结果。对于污染严重的色谱柱，将固定相取出再生后重新装填。

    去除固定相中金属离子的方法：将乙酰丙酮加入到填料当中，超声1～3min，萃取出残留在填料中乙酰丙酮。反复用甲醇萃取3次后对固定相加以评价。电子天平 旋光仪    色谱柱效评价条件：流动相，甲醇：水（85：15）；流速，1.0ml/min。样品：芴；浓度：2×10^-5g/ml；进样量：20μl；检测波长：254nm。

    固定相中金属离子残留评价条件：流动相，甲醇：0.5%乙酸钠（60：40）；流速，1.0ml/min；样品：乙酰丙酮（取10μl乙酰丙酮用甲醇溶解并稀释到100ml容量瓶中）；检测波长：254nm。

3   结果与讨论

3.1 RPLC固定相的通用再生方法

    推荐的常规分析用RPLC色谱柱再生方法为：采用100%甲醇→100%异丙醇→100%正己烷（或100%的二氯甲烷）一次冲洗色谱柱，最低应使20倍柱体积的每种溶剂通过色谱柱，流速控制在1～2ml/min。清洗之后为了返回原始的流动相体系，使用上述溶剂按相反的顺序再次冲洗色谱柱。

    考虑到N,N’-二甲基甲酰胺（DMF）具有黏度小，能与水和大多数有机溶剂以及许多无机液体混溶的特征，本文以其作为冲洗剂，与丙酮结合进行色谱柱的再生（每种至少20倍柱体积）。表1中给出了采用两种方法进行色谱柱（Silica A ODS 5μm）再生结果的对比。

                         表1  不同清洗方法的对比（3次试验的平均值）

	不对称度	塔板数×104N/m
清洗之前	1.05	4.4
通用清洗方法	1.02	4.7
新清洗方法	1.01	6.6

    从表1的实验数据可以看出，传统方法清洗的填料，柱效提升并不多，而用新方法清洗之后，柱效可以得到较大的提高。

    此外，采用传统的清洗方法不仅需要大量的有机溶剂，同时也需要较长时间去除清洗剂。新方法不仅清洗效果好，且简便快捷，只需要依次用N,N’-二甲基甲酰胺、丙酮清洗反相色谱柱，折光仪 盐度计 张力传感器  然后用色谱纯甲醇过渡一下，就能达到较好的再生效果。

3.2 RPLC固定相中残留金属离子的清洗

    硅胶基质中如果残留大量金属离子，可导致被分离物质谱峰拖尾，造成定量分析的较大误差。目前商品化的RPLC固定相中残留金属离子很少，一般不会对分析结果造成影响。但是，对于使用时间较长的色谱柱，尤其样品“较脏”，可能会使RPLC固定相中的金属离子含量增高，影响色谱分离。

    已有的多种除去填料中金属离子的方法包括：采用磷酸冲洗，0.1mol/L柠檬酸，0.05%EDTA-2Na水溶液等各种络合剂冲洗。用磷酸虽然能除去硅胶基质中的金属离子，但它同时也对填料键合相有一定的破坏作用；0.05%EDTA-2Na水溶液虽然也能除去填料中的金属离子，但对于密度小于水溶液的填料，由于大多数填料都浮在水溶液表面，无法清洗，同时EDTA-2Na带入钠离子，也会对固定相性能产生影响。

    乙酰丙酮能溶于水、甲醇、三氯甲烷、四氯化碳、苯等溶剂，有醇式和酮式两种异构体，可以与多种金属离子形成络合物，同时对反相填料有很好的润湿作用。Verzele等提出用乙酰丙酮来评价色谱柱填料中痕量金属的色谱法。乙酰丙酮可与金属离子形成络合物，当填料中金属离子很多时，可导致乙酰丙酮不出峰；而当金属离子只有少量时，乙酰丙酮尽管出峰，但是峰面积会减小，同时色谱峰拖尾严重，保留时间延后。基于乙酰丙酮的性能及Verzele等的原理，本文选用乙酰丙酮发展RPLC固定相中残留金属离子的清洗方法。

    将Silica A ODS 5μm和Silica B ODS 5μm填料按照2.2中的实验方法进行处理，并对处理后的固定相加以评价，结果在表2中给出，图1中也给出了Silica A ODS评价的实际谱图。

 

                 表2 填料中金属离子残留去除效果

填料	对比	保留时间（min）	不对称度	峰高（Mv）	峰面积（mV·sec）
Silica A	清洗之前	4.32	7.72	67	2828
ODS	清洗之后	4.14	1.55	197	3133
Silica B	清洗之前	3.90	3.90	186	3331
ODS	清洗之后	3.82	2.81	227	3481

    从表2的结果可以看出，清洗之后，乙酰丙酮的出峰时间提前，谱峰不对称度减小，峰高和峰面积都明显增加。说明乙酰丙酮清洗的方法能有效除去填料中的痕量金属离子。

3.3 RPLC固定相中蛋白质污染的清洗

    蛋白质对于RPLC固定相的污染是一类常见问题，Majors对这类色谱柱的清洗方法作了系统地论述。一般情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质，因此不能有效地清洗组织。然而，有机溶剂和缓冲液、酸、离子对试剂等的混合物则能有效地溶解蛋白质。可以用20倍柱体积的1%乙酸水溶液，1%三氟乙酸，0.1%三氟乙酸-正丙醇（40：60），三乙胺-正丙醇（40：60），5～8mol/L尿素或胍的水溶液，0.5～1.0mol/L NaCl、Na₃PO₄或Na₂SO₄水溶液，二甲基亚砜-水或二甲基甲酰胺（50：50）清洗，然后置换到常规流动相体系中。

    Bidlingmeyer等建议采用SDS溶液清洗色谱柱，也有人建议使用6M盐酸胍水溶液，过滤后与异丙醇按1：1混合，进样250μl，并用50%异丙醇水溶液冲洗。胍的“活塞流”几乎可以将所有污染物清除，但这种方法对色谱柱的损害较大。对于4.6mm i·d的分析柱，可进样500μl 1%SDS，5-95%乙腈/水（含0.1%TFA）梯度运行，常常可达到较好的效果。

4   小结

    对于色谱柱填料的再生，有针对性地清洗，才能达到最好效果。本文发展了一种再生RPLC固定相的通用方法：N,N’-二甲基甲酰胺→丙酮，具有清洗效果好、简便、快捷的特点。也基于乙酰丙酮的性能，发展了除去固定相中金属离子杂质的方法，乙酰丙酮对反相填料有很好的润湿作用，同时其强络合作用能够更有效地去除金属离子。蛋白质在色谱柱中的污染可以采用多种去除方法。大多数方法中采用较为极端的pH等条件，极容易导致固定相的损伤，本文建议采用SDS溶液进行色谱柱清洗，通常可以达到较好的效果。