原创 DNA测序的操作步骤

DNA测序的操作步骤

DNA（为英文Deoxyribonucleic acid的缩写）,又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。

DNA测序
1．PCR测序反应
　　(1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
　　(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物  水份计| 水份仪| 分析仪| 溶氧计| 电导度计| PH计
　　(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
　　(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
　　(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．电泳前测序PCR产物的处理。
　　(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
　　(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
　　(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。
4．上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。