原创 受活字打印启发的 3D 自由组装模块化微流体

前言

可重构的模块化微流体为灵活构建先进微流体系统的原型提供了机会。然而，直接集成模块的策略无法轻松满足常见应用的要求，例如，掺入具有生化相容性和光学透明度的材料，以及执行用于实验室试验和初始测试的一次性芯片的小批量生产。在这里，我们提出了一种受活字打印技术启发的制造方案，以实现3D自由组装模块化微流控。双层3D微流控结构可以通过复制组装好的模具来生产。展示了一个模块化模具库，用于流量控制、液滴生成和操作以及细胞捕获和共培养。

介绍

近三十年来，微流控技术在生物研究、生物医学诊断、材料合成和分析化学等科学和工程领域的应用中取得了显著进展。微流控技术的快速进步得益于先进微加工技术的发展，例如软光刻、激光直写和3D打印技术。通常情况下，微结构被设计和集成在单颗芯片上，以实现芯片实验室（LOC）的总体目标。制造具有单片整体结构的微流控芯片适用于批量生产阶段，但在研发初期可能不是一个有利的策略，因为其不具备更换部分结构的灵活性。而微流控结构的模块化是使用多个模块构建微流控系统的另一种策略，其应用具备可重构性、灵活性和多样性特点。因此，模块化微流控系统由于其突出的特点，在微流控界引起了极大的关注。

以前报道的模块化微流控系统几乎普遍是通过将一组微流控模块组装在一起来实现的。每个微流控模块都具有对应于特定微流控功能的特定结构。这些微流控模块可以采用不同的技术生产。其中一种流行的生产微流控模块的技术基于软光刻。具体而言，先在晶圆上制造数十个微结构，然后将其转移到弹性体材料上（例如聚二甲基硅氧烷（PDMS）），从而构建出微流控模块。这些微流控模块可以通过彼此粘接灵活地组装成一个完整的系统。此外，这些微流控模块可以通过3D打印技术直接制造。然而，如何同时满足高打印分辨率、高表面光洁度以及所使用材料的生物化学相容性和高光学透明度要求，是3D打印技术面临的巨大挑战。使用3D打印模具或铝（Al）模具铸造的PDMS微流控模块提供了一种折衷的解决方案。然而，制造分段式一次性PDMS微流控模块的效率很低，尤其是对于小批量生产而言。对标准化注塑单元进行改进，例如乐高积木，是生产定制化微流控模块的一种简易方法，但在数十微米的尺度上制造3D结构面临着挑战。

据麦姆斯咨询报道，受活字印刷技术的启发，上海理工大学、中国科学院深圳先进技术研究院和加拿大曼尼托巴大学（University of Manitoba）的研究人员合作开发了一种用于微流控制造的3D自由组装模块化微流控（3D-FAMM）方案。在该方案中，用于流体控制和其它功能配件（例如阀、照明光源和显微镜摄像头）制造的模具被模块化为标准化部件，通过复制组装好的模具并安装配件即可构建所需的微流控系统。该3D自由组装模块化微流控系统的非凡之处在于：（1）构建一体化微流控系统的灵活性；（2）模块化模具和配件的可重复使用性；（3）具备生化相容性和光学透明性的材料具有广泛的选择性；（4）具有尺寸和连接结构的标准化以及标准操作程序（SOP）；（5）易于制造；（6）成本效益高。使用该平台，展示了各种3D-FAMM系统在多种应用中的应用，包括复杂的浓度梯度生成，液滴生成和操作，细胞捕获和细胞共培养。

图1 活字印刷技术和3D自由组装模块化微流控（3D-FAMM）系统原理图

结果

概念

3D-FAMM的灵感来自活字打印技术。3D-FAMM的制造过程，参考活字印刷的主要步骤（图1a），如图1b所示。模块分为两组，即模具和附件。3D打印的不是为整个微流体结构生产模具，而是将具有小部分结构（例如微通道，分路器和混合器）的模具碎片打印出来，并且可以排列成任何所需的大型结构。除模具外，还准备了各种附件，包括光源、显微相机和气动阀，可以安装在微流控芯片上以丰富功能。所有模具和附件的设计都遵循定义尺寸和连接的标准。

通过将模具排列在框架和格子中来创建整个微流体结构。在第一层，模具在框架中组装。将硅橡胶条插入框架以压实模具。不锈钢管可根据需要插入模具中，例如入口、出口和层间连接。为了在第二层上创建微观结构，将格架放置在框架上，并将顶部的模具安装到格子中。一旦模具全部组装完成，PDMS就会倒入框架中。在60°C固化6小时后，将PDMS从模具中脱模。PDMS的底面粘合在玻璃板上，顶部覆盖着PDMS薄膜。微流控芯片中的空位是为模块化附件保留的。

3D-FAMM套件，包括模具、附件、框架和格子。每个模具或附件都用作一个模块。模块化尺寸定义为 5 × 5 mm2（长×宽）。底部模具的高度为3毫米。两侧的模具对齐。模具通过投影微立体光刻3D打印生产。可实现高达 15 μm 的特征尺寸和 5 μm 的薄层厚度。、

表征

模具尺寸的一致性会影响微结构的组装和微通道的对齐。长/宽和高度的制造误差分别为-4.9至4.4μm和-1.6至1.3μm。模具的粗糙度可以忽略不计。在我们的设计中，微通道接口标准化为130μm×100μm（宽度×高度），这是可以容忍的20个串联模具的最坏情况累积误差。此外，将两个宽度为3 mm的硅橡胶条插入框架以压缩模具。变形，即应变ε <0.004，位于线弹性区域。一旦施加在模具上的压缩被抽出，模具就可以恢复到原来的形状。因此，模具不会损坏，并且可以在不同的应用中重复使用。

3D打印很难实现连接微通道的完美端面。粗糙端面造成的间隙在复制的微通道中形成隔墙，导致流动阻塞。这些间隙用硅油填充（图2a，b）。图2c显示了在框架中组装的模具以建立S形微观结构。微通道的宽度在模具中心为100μm，在边缘逐渐加宽至130μm，以符合界面标准。微通道的高度为100μm。组装模具后，将硅油滴入框架四个角的孔中。在实验中，将硅油用红色溶剂染色以进行示踪。由于毛细管力，硅油通过间隙散布在结构上（图2d）。由于硅油（ρ油=1.208 g/cm3）的密度高于PDMS（ρPDMS = 1.03 g/cm3），硅油在结构复制过程中仍留在间隙中。图2e演示了将红色墨水注入成品芯片的过程。流体沿着S形微通道平稳流动。既没有观察到泄漏也没有堵塞，证明了3D-FAMM的可行性。

图2：3D-FAMM芯片的组装。

在该研究中，制造的标准化微流控模块具有三维结构，可以灵活地排列在框架和网格结构中，以构建用于制造双层微流控结构的完整模具。标准化制造平台用于调控所制造微流控模块的尺寸、层间/层内连接的结构和组装过程，从而使得在至少有20个微流控模块串联排列的情况下，其微通道的对准偏差是在可接受范围内的。此外，插入框架中的微流控模块的形变发生在线性弹性范围内，因此，微流控模块不会被损坏，并且可以在其它微流控系统中再次使用。此外，由3D打印工艺的公差造成的微流控模块之间的任何间隙都可以用硅油填充。因此，复制的微流控芯片中的微通道是畅通的。此外，该标准化微流控模块的双层特性将有利于构建具有复杂网络的微流控系统。

图3a展示了双层3D-FAMM的制造和操作。底面的模具组装在框架中。然后，将格子放置在框架上。顶部的模具安装在格架上，与底部的模具对齐。将钢针插入模具中并连接两层上的微观结构。脱模后，PDMS芯片的底面粘合到玻璃板上。在芯片的顶部，在坑的底部创建了微通道。将厚度为20μm的PDMS薄膜粘合到凹坑底部以密封微通道。

图3 3D自由组装模块化微流控（3D-FAMM）芯片的制造

气动阀用于控制流体运动。每个阀门都嵌入到基坑中并通过气压驱动。当阀门打开时，对相邻的弹性膜施加气动压力，薄膜变形以堵塞通道。在气动压力停止后，薄膜表现出弹性恢复，使得通道变得畅通无阻。

图3b示出了完全组装的3D-FAMM芯片。该芯片包括两个微通道，即一个m形微通道和一个直线微通道，它们相互交叉。在每个交叉点，垂直互连通道（VIA）连接第一层的通道和第二层的旁路。在其中一个交叉点上放置了一个气动阀。蓝色墨水注入m形微通道，红色墨水注入直线微通道。两种流体的流速为 1 μL/min。阀门首先打开以阻塞m形微通道的一个分支（图3c）。分裂成两根树枝后，蓝色的墨迹停在了一根树枝的阀门上，另一根树枝上，墨迹在笔直的微通道上大步流淌。红色墨水沿着直线通道流动，穿过第二层的旁路。阀门关闭后，蓝色墨水从两个出口流出芯片（图.3d）。红色墨水在另一个单独的微通道中不断流动。没有发生流体混合或泄漏。

在3D-FAMM中，可以使用两层灵活地排列复杂的微流体结构。层间通孔和旁路建立了微观结构的联系，抵消了几何约束。此外，主动流体运动控制可以实现可重新配置和可编程微流体的架构。

浓度梯度生成

设计浓度梯度是各种生物和化学应用中的一项基本技术，包括药物筛选、免疫测定和材料合成。微流体中不同浓度的微环境的创建引起了极大的研究关注。已经证明了许多浓度梯度生成方案。圣诞树设计是一种流行的方案，广泛用于许多应用，其中两种或多种不同浓度的流体以帕斯卡三角形的模式注入网络。经过逐级流体分解和混合后，可以生成一系列具有浓度梯度的流体。通过设计具有特定液压阻力的混合通道，可以生成复杂的浓度曲线。

演示了使用我们的3D-FAMM生成圣诞树浓度梯度（图4）。组装了9×10模具阵列，包括入口/出口，90°旋转通道，1对2分配器，混合器和腔室模具，以建立两级圣诞树结构（补充图6）。混合器具有锯齿形结构（补充图7）。在微通道的每个转弯处，都有轻微的凸起。这些凸起有助于平流的增强。因此，与没有凸起的锯齿形结构相比，混合效率显着提高

图4：生成具有复杂轮廓的浓度梯度。

在实验中，蓝色墨水和去离子水分别从两个入口注入芯片中。进样流速为1μL/min。在腔室中观察到流体浓度的变化，其与颜色变化成线性比例，并通过比色分析得出。当混合器相同时，分支通道中的液压阻力相同，分流比为1：1（图4a）。在腔室中，流体的浓度呈逐步增长，沿流动横向均匀分布四个水平（图4b）。此外，只需修改结构即可灵活交换第 2 阶段的输出。4通道扇入/扇出模具更改为带交叉的模具，如图4c中的蓝色虚线框所示。在第二层上建立旁路，以连接第一层微通道的两端。由于第 2 阶段的中间两个输出在空间上交换，因此合并的流体显示出具有波动的逐步浓度曲线（图 4d）。这种浓度曲线不是单调的，不能在传统的单层圣诞树结构中产生。

此外，随着管网中液压阻力的变化，可以调整浓度曲线。搅拌机的液压阻力由其尺寸决定。为了将搅拌机的占地面积保持在模块化尺寸内，制造了不同高度的搅拌机（图4e）。第1阶段的三个混合器保持恒定（高度= 100μm），而第2阶段的四个混合器被补充图10c中列出的混合器替换。分裂后水力阻力的不等式导致两个分支通道中的流速不平衡。使用不同的混合器测量浓度曲线（图4f，h）。管网中液压阻力的排列对流量和输出处的浓度有重大影响。因此，三种情况下合并流中的浓度梯度有很大不同。3D-FAMM 圣诞树浓度梯度发生器通过布置具有适当液压阻力的混合器，有可能实现理想的浓度曲线。3D-FAMM表现出以简单的方式修改部分结构的卓越能力，这在实验室试验和生产测试阶段是有利的。

液滴生成和操作

基于液滴的微流体或数字微流体提供了一个高通量、小体积的反应平台，可用于使用有限的样品以极高的效率进行分析。基于液滴的微流体的关键功能由3D-FAMM系统证明。用于液滴生成和操作的3D-FAMM设计如图5a-e所示。这些模块可用于构建各种基于液滴的微流体系统。

图5 液滴的生成和操纵

液滴发生器具有改进的T型结结构和3D喷嘴配置。与传统T型结的发生器相比，具有3D结构的发生器可以以更高的速率产生更小的液滴。由于横截面在3D结构运行期间会收缩，因此离散相的舌头填充主通道所需的时间更少。此外，颈部通过喷嘴的大曲率允许连续相轻松挤压和折断舌头。图5f显示了液滴的形成。当离散相的流速固定时，可以增加生成速率，并且随着连续相流速的增加，液滴的尺寸可以减小，如补充图13a所示。如果两个T型结结构排列在主通道的两侧（图5b），则可以使用不同的毛细管数（Ca）和流速分数（Φ）实现交替液滴，合并液滴和层流的产生（图5g）。

在液滴发生器之后可以添加各种用于液滴操作的模块。例如，可以使用注射模块将流体添加到液滴中（图5c）。在这种设计中，主通道在注射点之前突然变窄，形成文丘里管。通道的突然变化导致注射部分的压降。因此，文丘里效应允许注射在低压下操作，确保其稳定性。此外，液滴在窄通道中被拉长，以便可以实现大体积进样，如图5h和补充视频3所示。通过控制注射速率，可以灵活调节注射量。进样体积范围从 0.06 nL 到 0.44 nL。

具有鱼骨结构的模块设计用于液滴合并（图5d）。主鱼骨通道有三个梭形室，与两侧的两个辅助通道相连。由于分配流体从主通道流入辅助通道，因此后腔室中的流速低于前一个腔室中的流速。使用交替液滴演示液滴合并，如图5i和补充视频3所示。当一个液滴沿着主通道流动时，它在每个腔室中都减速，好像在等待下一个液滴。一旦后续液滴碰到前一个液滴，两个液滴就会合并。

此外，液滴分裂在Y形结构模块中得到证明（图5j，k）。在这种液滴生成中，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的HBEC3-KT细胞被封装到液滴中。一旦液滴通过Y型结，它就会分裂成两个子液滴。携带细胞的子液滴在具有相同结构时随机进入两个分支（图5j）。如果其中一个分支中包含3D障碍物，即高度从100μm突然变化到10μm，则携带细胞的子液滴仅进入另一个分支（图5k）。

细胞捕获和共培养

尽管3D打印的打印分辨率（线宽≥15μm）阻碍了微米级结构的设计，但层厚度（5μm）与单个电池的大小相当。因此，已经开发了用于细胞捕获和共培养的模块。

图6a示出了细胞捕获模具，其中有多达6000个陷阱。脱模后，每个PDMS捕集阀都具有U形结构，入口宽度为30μm。陷阱底部有一个宽度为15μm，高度为5μm的小间隙。由于间隙的存在，空置疏水阀上的压降驱动微粒沿流线进入疏水阀，如图6b、c所示。当疏水阀被占用时，粒子绕过疏水阀并被成功的疏水阀捕获。使用细胞捕获模块构建用于细胞捕获和荧光染色的微流体平台（图6d）。将HBEC3-KT细胞、DAPI荧光染料和洗涤缓冲液依次注入微流控芯片中。捕获阵列可以有效地捕获细胞（图6e），表明具有高制造精度的微观结构能够拦截微尺度弹性颗粒。由于陷阱的体积与细胞的大小相匹配，单细胞捕获效率达到81.5%（图6f）。

图6 细胞捕获和荧光染色

在细胞共培养演示中，开发了用于显微成像的camara和照明模块，如图7a，b。在相机模块中，有一个内窥镜相机，一个球透镜和一个光学带通滤光片（中心波长在450nm，520nm或620nm）。视场为1300×1300μm，分辨率为2.2μm（补充图20）。照明模块配有LED、光学带通滤光片和半球透镜。在模块旁边产生白光斑或具有特定波长（365 nm、480 nm 或 535 nm）的光斑。这些附件为建立一体化微流体平台提供了一种有前途的解决方案。此外，还演示了具有两个腔室的细胞共培养模块（图7c）。可以将两组细胞分别注入两个腔室中，并通过具有小间隙的大坝隔离，允许腔室之间的互流，如图7d所示。将K562和K562 / ADR电池装入两个腔室。将阿霉素（500ng mL−1）加入到腔室中。在细胞活力测定中，将钙黄绿素乙酰氧基甲酯（钙黄绿素-AM）和碘化丙啶（PI）荧光染料和洗涤缓冲液依次注入芯片中。然后，将照明模块和相机模块安装在芯片上以激发细胞并记录荧光发射，如图7f所示。K562/ADR细胞中钙黄绿素-AM绿色荧光发射在48 h内的一致检测证实了耐药性的特征，而K562细胞中荧光发射的变化表明细胞逐渐恶化并且对药物敏感。

图7 细胞共培养及其在耐药分析中的应用

讨论

总之，我们提出了一种新的方案，3D-FAMM，用于制造和修改不同的微流体系统。该方案的灵感来自活字印刷技术。我们的3D结构标准化模块可以灵活地布置在框架和格子结构中，为双层微流控结构构建整个模具。标准平台规定了模块的尺寸、层间/层内连接的结构和组装程序。微通道的错位是可以容忍的，至少连接了20个模块。插入框架中的模块的变形发生在线弹性区域。因此，模块不会损坏，并且可以在其他系统中重复使用。此外，由于3D打印过程的公差而导致的模块之间的任何间隙都可以用硅油填充。因此，复制的微流控芯片中的微通道是畅通无阻的。

已经开发了各种各样的模块，用于流量控制、液滴操作、细胞拦截和隔离、气动阀门控制、照明和成像。在目前的3D-FAMM方案中，采用投影微立体光刻3D打印技术制造模块。或者，应用其他先进的3D制造技术（例如直接激光写入和基于电沉积的3D打印）46来制造模块是可行的。此外，模块库可以扩展，以包括更多用于流体控制的模具和功能附件，以取代外围笨重的设备。

3D-FAMM方案为微流体系统的原型设计提供了一种新技术。在研究和开发上述应用中使用的工具时，包括浓度梯度生成、液滴生成和操作、细胞捕获和药物筛选，使用模块化模具和附件构建和修改微流体系统非常方便。我们建议可以广泛采用3D-FAMM方案来推进微流体的设计和工具。

材料和方法

3D-FAMM芯片的制造工艺

图1b显示了3D-FAMM芯片的制造过程。模具和附件的结构由计算机辅助设计软件（Autodesk AutoCAD）设计。然后，通过投影微立体光刻3D打印机对模具和附件进行3D打印。使用生物相容性树脂作为印刷材料。框架和格子由分辨率为25μm的计算机数控（CNC）铣床制造。模具基于微流体结构在框架中组装。两个硅橡胶条插入框架和模具的间隙。将不锈钢管插入模具的预留孔中，例如入口、出口和用于层间连接的孔。然后将用结晶紫染色的甲基苯基硅油滴入框架四个角的孔中。为了制造双层3D-FAMM芯片，将格子放置在框架上。第二层的模具安装在格子中。将PDMS预聚物以10：1（预聚物和交联剂之间的重量比）的混合物倒入组装好的模具中，然后在60°C下固化。 4小时后，将PDMS微流控芯片从模具中脱模并用乙醇洗涤以除去残留的硅油。应用等离子体处理对PDMS微流控芯片的两侧进行修饰。芯片的底面密封在玻璃基板上，而顶部的微结构被尺寸为4毫米×4毫米×200微米的PDMS薄膜覆盖。最后，将芯片在80°C下加热2小时。阀门模块、照明模块和摄像头模块等功能模块安装在预留的空位上。单层和双层3D-FAMM芯片的厚度分别为~3 mm和8 mm。

模具和硅橡胶棒的表征

使用分辨率为500nm的数字千分尺卡尺测量模具的尺寸。测量了80个模具，其尺寸与设计值一致。两个组装模具的间隙填充过程（图2b）由光学接触角计监测。应力应变曲线（补充图3b，c）通过应力计测量，定量分析屈服点和杨氏模量。模具和硅橡胶棒的杨氏模量分别为769 MPa和7.8 MPa。

化学溶液的制备

在浓度梯度生成中，将 150 mg 艾瑞奥青碱二钠盐溶解在 5 mL 去离子水中以制备蓝色溶液。过滤溶液以去除杂质和未溶解的颗粒。实验中采用制备的蓝色溶液和去离子水。

在液滴生成和操纵中，矿物油用表面活性剂（2.25% Span 80、0.20% 吐温 80和 0.02% Triton X-100处理以制备油相。蓝色溶液用于浓度梯度生成，去离子水用作水相。油相的动态黏度μ为16 mPa·s。这些化学品是为每个实验新鲜制备的。

流体动力学模拟

流体动力学仿真使用 COMSOL Multiphysics® 软件进行。模拟中使用了微观结构的3D模型。在液滴生成和操纵的模拟中，流体的压力场、速度场和流动轨迹在静止状态下的单相层流系统中进行。此外，采用水平集法的两相流系统对瞬态下液滴形成过程进行建模。在细胞捕获模拟中，计算了静止状态下单相层流系统中的流体流动行为。将直径为24μm的珠子任意放置在陷阱中以模仿细胞的存在。

细胞培养和制备

HBEC3-KT人支气管上皮细胞系在Dulbecco的改良培养基（DMEM）中培养，含有10%胎牛血清（FBS），100U mL-1青霉素和100μgmL-1链霉素。在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养K562和K562 / ADR人骨髓性白血病细胞系，并补充有10%胎牛血清（FBS），100 U mL−1青霉素和100 μg mL-1链霉素。然后，将500 ng mL−1阿霉素加入K562 / ADR细胞系的培养基中以维持耐药性。所有细胞均在37°C的培养箱中培养，并用5%CO 2。

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