原创 基于微流控芯片的核酸适配体筛选技术研究进展下

微阵列芯片 SELEX 技术筛选适配体

微阵列芯片及其分类

微阵列芯片是通过微点阵技术或微颗粒填充技术将数以万计的生物探针固定在基板上,通过生物探针与溶液中的待测分子特异性结合完成分析和检测过程。 微阵列芯片表面不存在微通道、微腔室等微结构,无需考虑流体在芯片内部流动造成的堵塞和气泡等问题,降低了芯片加工和使用的难度。 另外,微阵列芯片的实验结果可通过计算机阵列分析技术获得。

核酸微阵列芯片与蛋白质微阵列芯片

核酸微阵列芯片常以玻璃、硅和塑料作为基板材料,通过光引导原位合成技术或物理递送技术制造高密度核酸阵列,其中,物理递送技术,如喷墨或微喷射沉积,可将纳升甚至皮升的溶液体积分配和点样到微阵列芯片的特定部位。 微阵列芯片上检测探针与带有修饰的报告探针(如荧光、化学发光、放射性同位素等) 结合,通过检测报告探针完成信号检测。

与核酸微阵列芯片相同,蛋白质微阵列芯片的构建最初是直接将蛋白质点样在相关载体上。 常用于制作蛋白质微阵列芯片的载体有硝酸纤维素膜、硅树脂、玻璃和塑料等。 载体的固定对蛋白质的生物活性和空间结构的维持有一定的影响。 另外,常见的蛋白质微阵列芯片的制备工艺中通常只点样一种蛋白质,将多种蛋白质点样在一块微阵列芯片上的报道较少。

微颗粒阵列芯片

微颗粒因其具有比表面积大、结合动力学快的特点而在生化分析中得到广泛应用。 与传统的平面微阵列芯片相比,微颗粒微阵列芯片利用其上的微颗粒可实现对生物分子的更快、更灵敏的检测。 同时,微颗粒微阵列芯片易实现多种蛋白质的固定。

掺杂 DMAP 和丙烯酰胺/ 双丙烯酰胺的溶液按照掩膜图案进行交联反应,形成微阵列芯片的微结构,并采用物理俘获法实现微颗粒在微阵列芯片上的填充,有效克服了静电自组装和电场辅助组装中微颗粒必须带电的问题。 每块芯片上有 40 个凝胶垫阵列单元,每个单元外周均以聚乙二醇微柱作为亲水屏障,将试剂和样品限制在微阵列芯片上。他们利用该芯片初步实现了前列腺特异性抗原和人绒毛膜促性腺激素的免疫测定。 Kim 等报道了一种微颗粒阵列芯片的加工工艺,即用停流光刻法进行微颗粒的加工,通过负压法实现微颗粒在阵列芯片上的填充。 另外,他们还通过改变掩膜图案,制作出形状各异的微颗粒,并成功生成了防伪应用程序的二维粒子阵列代码。

微阵列芯片不存在气泡等问题带来的干扰,而且微阵列芯片上固定的靶标数量大、种类多。 特别是微颗粒阵列芯片的出现,可使不同靶标分子固定于不同微颗粒上,再将这些微颗粒填充于相应区域,便于检测且不会产生干扰。 微阵列芯片与 SELEX 技术的结合为发展新型适配体筛选技术提供了思路。

微阵列芯片 SELEX 在适配体筛选中的应用

基于溶胶-凝胶的微阵列 SELEX 技术筛选适配体

基于微阵列 SELEX 技术筛选适配体时,研究者将蛋白质靶标包裹于凝胶颗粒内,再点样于微阵列芯片上,可有效维持蛋白质的生物活性和空间结构。 例如,Park 等将包裹有蛋白质的凝胶颗粒点样在微加热器上,在微混合器的作用下,先后在微阵列芯片上完成寡核苷酸文库与靶标分子的结合、洗涤和洗脱等过程。 目前,利用该芯片可同时实现 5 种靶标分子适配体的筛选。

溶胶-凝胶颗粒已广泛用于大分子的捕获,但将其应用于小分子的捕获时仍存在一定挑战,原因在于,若将溶胶-凝胶设计为截留小分子,通常会损害溶胶-凝胶颗粒与常规基质(如微量滴定孔板聚合物)的粘附性。Ahn 等基于阳极刻蚀技术和电化学工艺开发了一种多孔聚苯乙烯(PS)基质,该材料可有效锚定多种不同孔径的溶胶-凝胶颗粒(图 4)。 研究者将包裹双酚 A 的溶胶-凝胶颗粒固定在 PS基质上,考察了基于溶胶-凝胶颗粒的微阵列芯片 SELEX 技术筛选双酚 A 适配体的可行性,为小分子适配体的筛选开辟了一条通用途径。

图 4 基于聚苯乙烯-溶胶凝胶芯片的适配体筛选技术示意图

微阵列耦合微流控的 SELEX 技术筛选适配体

微流控芯片技术能较好地集成靶标分子与寡核苷酸文库的结合、洗涤和洗脱等筛选步骤,而微阵列芯片的超高通量的特点也有助于实现多个靶标分子适配体的同时筛选。 因此,微阵列耦合微流控的 SELEX 技术在适配体筛选中具有更大的优势,可发挥更大的作用。

Liu 等发展了一种微阵列耦合微流控芯片的 SELEX 技术( Protein microarray integrated with amicrofluidic chip, PMM-SELEX),用于筛选蛋白质的适配体(图 5)。 利用物理俘获法将靶标分子吸附在微阵列芯片的蛇形微通道上,在靶标分子与寡核苷酸文库结合后,通过微阵列芯片扫描技术检测靶标分子与寡核苷酸文库的结合情况。 研究结果表明,PMM-SELEX 技术省时、高效,仅需 5 轮筛选即可得到对乳铁蛋白具有较高亲和力(Kd = 0. 63 nmol / L)的适配体。

Gortrik 等通过将寡核苷酸文库固定在微阵列芯片上,筛选出多条适配体候选物,并通过微流控技术和高通量测序技术分别实现了适配体的分离与测序,克服了筛选过程轮次多、鉴定耗时等缺点。

图 5 蛋白质微阵列耦合微流控芯片的适配体筛选原理示意图

适配体对(Aptamer pairs)可同时识别靶标分子不同表位,有助于增强检测的灵敏度和特异性。然而,适配体对很难通过筛选得到,因为在常规筛选过程中会优先产生可识别显性“热点冶表位的适配体,而热点表位适配体的确定,对另一表位的结合存在一定的阻碍作用。Cho 等建立的基于微阵列芯 片 的 适 配 体 对 筛 选 平 台有效克服了这一问题,实现了适配体对的筛选(图 6)。

图 6 基于阵列的多价适配体筛选平台示意图

基于微流控及微阵列芯片 SELEX 技术的适配体筛选进程监测技术

适配体的筛选过程必须配合实时监测技术,从而有效地获得具有更高亲和力、更强稳定性的适配体。

表面等离子体共振(Surface plasmon resonance, SPR)通过适配体候选物与靶标分子结合引起的金属膜表面共振角的改变对 SELEX 筛选进程进行监测。 虽然,利用 SPR 容易对适配体候选物与靶标分子的结合情况进行评估,但早期研究发现,大多情况下,第 1 轮筛选并未检测到 SPR 信号的变化,显然传统的 SPR 并不适于高通量检测。 将金纳米颗粒引入 SPR 的局域表面等离子体共振可有效增强 SPR 信号的输出。

Gifford 等使用金纳米颗粒增强的 SPR 成像技术实现了 PCR 产物的高灵敏检测。 与金纳米颗粒相比,银纳米颗粒可产生更强的共振信号,据此构建的“金核银壳冶结构可更好地监测筛选过程。 Jia 等将微流控芯片和 SPRI 技术整合至 SELEX 过程中,利用十面体银纳米颗粒(Ag10 )增强表面等离子体共振信号强度,完成了对乳铁蛋白的适配体的筛选,将检测信号提高了 128 倍。 在后续的研究中,Jia 等利用十面体银纳米颗粒探针(Ag10-NPs-RP15 )在实时监测 SELEX 过程的同时,消除了因靶标分子末端固定导致的其与适配体候选物亲和力降低的影响,筛选得到了脂质运载蛋白-1(Lipocalin-1)的适配体。

表 1 传统 SELEX 技术与基于微流控芯片和微阵列芯片 SELEX 技术的对比

小分子与适配体分子量差异较大,两者亲和力的表征也是难点之一,目前尚无通用的表征方法。Ahn 等将包埋有 BPA 的溶胶-凝胶颗粒固定在微阵列芯片上,利用荧光素标记 BPA 适配体候选物,与小分子结合的适配体候选物无法从溶胶-凝胶颗粒中逃逸,从而可观察到颗粒的荧光。 但是,这种荧光标记探针的方式对适配体的折叠有潜在影响,可能会进一步影响适配体与靶标分子的结合。 表征小分子与适配体亲和力的另一种方法是反向散射干涉术(Back scattering interferometry, BSI),即利用激光照射样品,光束在通道内被反射和折射,形成特定的条纹图案,并由电耦合器件( Charge coupled device, CCD)实现阵列检测。 监测过程中,适配体和靶标分子均游离在溶液中,无需固定和标记。Kammer 等成功地将该技术用于抗生素(如替诺福韦、表阿霉素、氨苄青霉素和四环素)以及激素、神经递质等小分子与适配体的亲和力表征研究中。

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