标签: 核酸检测

在过去的三年中，核酸检测一直是我们日常听到最多的词语之一，但却鲜有人知道核酸检测中的核酸究竟是什么以及它是如何被提取的。今天点成向大家简单介绍一下核酸以及几种核酸提取的方法及原理。 点成小科普 Q：核酸是什么？ A：核酸是细胞内的一种生物大分子，负责着生物体遗传信息的携带和传递。核酸有脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类，DNA主要集中在细胞核、线粒体和叶绿体中，而RNA则主要分布在细胞质中。 核酸是当代分子生物学研究的基础和重点，许多生物学的秘密和疑难杂症都可以在核酸上找到答案，而核酸的提取作为开启研究大门的第一步，很大程度上也影响着实验研究的成功与否。 # 1 核酸提取纯化原则与要求 保证核酸一级结构的完整性； 排除其他核酸分子的污染干扰（提取DNA时排除RNA干扰）； 核酸样品中不应有对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子； 尽量将样品中其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降低到最低水平； 核酸提取纯化的基本步骤 # 2 核酸提取常见方法 1.苯酚氯仿抽提法 核酸提取的经典方法。 通 过苯酚氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解的是以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是多糖和脂类物质，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸，之后再离心分离和纯化溶解即可得到高纯度核酸。 该法最大优势是 成本低，对实验条件要求较低 ；提取的核酸保持天然状态；获得的核酸纯度高、片段大、效果好。 缺点是操作较为繁琐。 2.煮沸裂解法 适用于提取细菌质粒DNA。 细菌染色体DNA多为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子，当加热处理样本溶液时，线粒体染色体DNA容易发生变性，而共价闭合的质粒DNA在冷却时就可恢复其天然超螺旋结构；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片会结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，此时可通过离心将两者分开，回收上清液中的质粒DNA。 煮沸裂解法提取DNA，得量少，杂质多，DNA可能会出现断裂，主要适用于一些 粗略的实验。 3.碱裂解法 适用于提取质粒DNA。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在强碱性条件下用SDS破坏和裂解细胞，使细胞蛋白质和DNA变性，释放出质粒DNA，细胞碎片、蛋白质和线粒体DNA会形成复合物沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，离心分离，去除杂质，DNA保持在上清液中，可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 对细菌的裂解、细菌染色体DNA及蛋白质变性充分， 提取的质粒DNA产量高、纯度好； 质粒DNA如果长时间暴露在强碱性下容易发生不可逆转的变性， 导致酶切困难 ，也 不适合大质粒的抽提 。 4.离心柱法 通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，通过离心分离和纯化核酸。 离心柱法 操作相对简单 ，在市面上应用较为广泛。 但是其具有样本需求量大，损失多，对于珍稀样本无能为力，同时 不便于高通量、自动化操作 等劣势。 5.磁珠提取法 运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。先使用细胞裂解液裂解细胞，带有活性基团的磁性颗粒可特异性吸附从细胞中游离出来的核酸分子，而样品中的其他干扰物则很好的移除了，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开完成，最后回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可得到纯净的DNA，获得质量较高的核酸模板。 磁珠法不需要离心、无需加入多种试剂， 操作简单 ，符合核酸 自动化提取 要求。 但是 成本较高 ，科研端使用很难普及。 # 3 点成推荐 磨刀不误砍柴工，点成生物DC-CNT-R44高速冷冻离心机，-20至40℃温度范围，500-15000 RPM调速范围，RCF高达22388g，还有高达999分钟定时范围或者无限模式，具有不平衡检测和盖锁安全设计，功能高端，性能可靠，绝对是您实验室的重要伙伴，可助力您加快实验工作。 我们还有许多不同的实验室仪器方案，如水浴锅、摇床、混匀器、灭菌器、移液器、微流控芯片等，适用于不同工作场景，仪器丰富，任君选择，欢迎来电垂询。

一、 应用场景 实验室离心机是一种通过绕固定轴 对物体进行旋转 ，使其受到离心力作用而 加速物质沉降速度 并实现 不同分子颗粒分离 的实验设备。 离心机广泛应用于化工、食品、制药、环保、教学、医疗等科学研究和生产部门，在物质分离和提取方面起到十分重要的作用，已成为现代科学研究重要仪器设备之一，更是生物学、生物化学、医学、生物工程、生物制药等行业科研与生产的必备设备。 二、 原理 离心是利用离心力将颗粒/不同沉降系数的物质从溶液中分离出来的一种技术。 离心机就是应用了离心原理，根据颗粒的大小、形状、密度、溶液粘度等差异，通过离心机上转子的高速旋转产生强大的离心力，加快混合液中不同比重成分的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离或分层分级，离心过程中密度较大的粒子会被更快地抛到离心管外侧，而较轻的颗粒则会移向中心，这样可以分离出悬浮液中的固体颗粒或者不同密度的液体成分。 （图片来源于网络） 三、 分类 目前市面上离心机的种类繁多，在不同领域有不同适用的离心机。根据转速不同、是否制冷、设备大小等标准可以进行以下分类： 根据转速不同，可以分为：低速离心机、高速离心机、超高速离心机等 根据是否制冷，可以分为：冷冻离心机和普通离心机等 根据应用场景，可以分为：实验室离心机和工业离心机等 根据设备大小。又可以分为：迷你离心机、台式离心机、立式离心机等 四、 实验室离心机常见应用 常用于不相溶液体的分离、 蛋白质提纯、悬乳液沉淀分离、细胞提取、DNA/RNA提取、PCR板离心、生物成分沉淀等应用。 （图片来源于网络） 五、 离心机在新冠病毒研究中的应用 在如今新冠肺炎疫情成为了常态性现状的背景下，对于新冠病毒的研究是当前生物学、医学等科研人员研究的一大重点。2020年初，北京协和医院就发布了新冠病毒操作指南，在整个参考实验过程中，病毒样本的裂解过程是多次需要使用到离心机的。 病毒样品的裂解过程中，全程都建议在生物安全柜中使用离心机，这样可以有效防止样品泄漏和污染带来的麻烦，实验中用到的 离心机转速要求需要达到8000rpm及以上 ，这属于高速离心机， 且要可适配低容量EP管 。 以下是官方提供的病毒样本裂解的参考过程： 1、用1.5ml的无菌离心管（EP管），移液器移取560μl 的AVL裂解液，并加入5.6μl Carrier RNA和140μl已灭活的待提取核酸的待测样本，涡旋振荡15s，室温静置10min； 2、将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染； 3、裂解完成后，向EP管中加入560μl无水乙醇，并振荡混匀15s； 4、再次将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染； 5、向离心柱加入裂解产物630μl，并用8000rpm转速离心1min；建议在生物安全柜中进行离心，防止样品泄漏和污染带来的危害；若离心机在生物安全柜之外，则每次使用前都需进行外表面消毒。 6、更换废液收集管，要从离心机中小心取出离心柱，将上层离心柱转移到新收集管中，继续将剩余裂解产物630μl加入离心柱中，若样本体积大于140μl时需重复此步骤，直到全部裂解产物都过柱离心，8000 RPM转速离心1min，之后小心地将离心柱转移到新的收集管中； 7、取500μl AW1加入离心柱中（注意，此处加样操作时务必将移液器吸头接触离心柱内壁缓慢加样），8000 rpm转速离心1min，小心取出离心柱，更换新的收集管； 8、取500μl AW2加入离心柱中，14000rpm转速离心3min，小心取出离心柱，更换新的离心柱上端收集管，置于离心机中使用最大转速离心1min，以确保将AW2中的残液完全离心干净； 9、取无菌1.5mlEP管收集核酸。将离心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脱液AVE加入到离心柱中（注意：洗脱液应尽量全部覆盖住离心柱膜），用EP管的管盖盖住离心柱，使用无菌剪刀剪去原离心柱管盖； 10、室温静置1min，将其放入离心机中8000rpm转速离心1min来回收核酸； 11、丢弃离心柱，此时EP管中就是我们想要提取的核酸了，之后做好标记与登记。