原创 用于辐射计量即时检测的高通量液滴微流控芯片

用于辐射计量即时检测的高通量液滴微流控芯片

随着核医学、核电等核技术的广泛应用，意外核事故等突发公共事件发生的可能性显著增加。机体受到高剂量电离辐射（> 1 Gy）后可导致急性放射综合征（ARS）。ARS常涉及多种组织器官系统的损伤，轻则出现恶心、呕吐等症状，重则导致死亡。根据不同的临床表现和结局，ARS一般分为造血系统型（2 Gy ~ 6 Gy）、胃肠型（6 Gy ~ 10 Gy）和脑型（> 10 Gy）等亚综合征，与人体吸收的辐射剂量紧密相关。因此，辐射暴露人员受照剂量的准确测定对于放射事故后潜在暴露个体的医学处置至关重要。在过去几十年里，细胞微核和双着丝粒测定等生物剂量测定方法已被用于辐射暴露的真实案例中。然而，这些检测方法仍然存在一定的局限性，特别是检测前需要最短48小时的细胞培养时间，因而难以实现简便、快速和高通量等要求。因此，亟需发现新的更为高效的辐射剂量生物标志物并开发高通量检测方法，以应对突发放射性事件中潜在受照个体的大规模筛查、诊断和医学分类。

近日，军事科学院军事医学研究院研究员周钢桥/卢一鸣团队与 北京航空航天大学生物与医学工程学院常凌乾课题组在 Nature Communications和 Biosensors & Bioelectronics期刊上发表系列研究工作，发现了基于RNA的N6-甲基腺苷（m6A）修饰的新型辐射剂量生物标志物，并开发了相应的高通量微流控芯片检测方法。首先，周钢桥/卢一鸣团队在 Nature Communications期刊上发表了题为“RNA N6-methyladenosine modification-based biomarkers for absorbed ionizing radiation dose estimation ”的研究论文。该研究首次发现了基于RNA m6A修饰的新型辐射暴露剂量生物标志物，并建立了基于该修饰的人体辐射暴露剂量预测模型，为意外核事故后辐射暴露人员受照剂量的高通量测定和医学分类提供了全新方案。

辐照小鼠PBMCs转录组和表观转录组的动态变化。

研究者首先对小鼠外周血单个核细胞（PBMC）中响应电离辐射的mRNA分子进行了全转录组筛选，发现急性电离辐射暴露后RNA m6A水平发生显著的变化。而且，与RNA转录水平相比，RNA m6A修饰水平的改变更加稳定和持久，提示其更适合作为暴露后中长期有效的辐射标志物。其中，Ncoa4、Ate1和Fgf22三个基因的RNA m6A修饰水平在辐射暴露小鼠PBMC中表现出良好的量效关系，提示它们可以作为辐射暴露的生物标志物。特别是，Ncoa4基因的RNA m6A在辐射暴露后长达28天仍处于显著升高状态，提示其作为理想辐射标志物的优良表现。研究者进一步排除了其他混杂因素，如炎症、性别和年龄等对量效关系的影响，证明了其对电离辐射的反应特异性。

m6A 修饰的 NCOA4 mRNA 在辐射暴露人类的 PBMC 中的反应

快速和高通量生物剂量计对于放射事故后的有效医疗管理至关重要，在放射事故中，大量个体可能会暴露在未知剂量的辐射下。在这里，我们对辐射响应的 mRNA 转录本进行了全转录组筛选，其 m6A 修饰水平揭示了急性辐射暴露后的显着变化。我们发现 Ncoa4、Ate1 和 Fgf22 三个基因的 RNA m6A 水平显示出良好的剂量反应性，因此可能作为辐射暴露的候选生物标志物。特别是NCOR4 mRNA的m6A修饰在跨物种保守性、剂量反应性、响应特异性和较长的辐射检测持续时间方面表现出优异的性能。据我们所知，这是第一项评估RNA m6A修饰作为候选生物标志物在检测辐射暴露中的应用的研究。

最近，几项研究揭示了m6A RNA甲基化与多种遗传毒性和非遗传毒性应激之间的密切关系。例如，在紫外线的应激下，m6A RNA 和 METTL16（一种 m6A 甲基转移酶）被募集到 DNA 损伤位点，并通过促进核苷酸切除修复 （NER） 途径促进 DNA 修复。亚砷酸盐诱导的氧化应激可以增加编码RNA m6A“写入者”的两个基因WTAP和METTL的表达，以及整体m6A水平，进而调节靶RNA响应氧化应激。作为对电离辐射的响应，METTL3（另一种 m6A 甲基转移酶）和 FTO（一种 m6A 去甲基化酶）已被证明以 RNA m6A 介导的方式有助于抗辐射。此外，新出现的证据表明 RNA m6A 对其他类型的应激起着关键作用，包括缺氧、治疗应激、代谢应激和内质网 （ER） 应激。因此，这些发现表明了关注RNA m6A修饰以筛选响应辐照的候选生物标志物的机会。

事实上，一些开创性的研究已经暗示了RNA m6A修饰作为多种疾病生物标志物的潜力。在癌症方面，基于IGF2BP2、IGF2BP3、KIAA1429、METTL3、EIF3H和LRPPRC表达的m6A评分被报道为胰腺肿瘤微环境状态的指标，是患者预后的潜在生物标志物。METTL3在多种癌症组织中的表达水平显著升高，与患者的不良预后有关。此外，证据还表明m6A甲基化相关基因的表达谱是代谢异常和心血管疾病的候选生物标志物。然而，到目前为止，还没有研究直接评估RNA m6A修饰本身作为生物标志物的能力。据我们所知，这是第一项评估特定基因的RNA m6A甲基化水平作为生物标志物的应用的研究，不仅限于辐射相关的生物标志物。综上所述，我们系统地筛选和评估了RNA m6A修饰在辐射剂量评估中的可行性。特别是m6A修饰NCOA4在剂量反应性、时间动力学、反应特异性和跨物种保守性方面的突出表现，表明其在辐射事故管理和临床应用中具有潜在的应用价值。

研究者进一步通过在小鼠、猴子和人类中的保守性分析发现，上述三个基因均具有跨物种高度保守的m6A修饰位点。尤其是，基于NCOA4基因中的保守m6A修饰位点，研究者分别建立了恒河猴、人类细胞系及人类PBMC的辐射暴露模型，发现在非人灵长类和人类中NCOA4 m6A修饰水平仍然具有良好的量效关系。此外，研究者招募了33例接受局部放射治疗的肿瘤患者，发现这些患者接受不同剂量放射治疗后其PBMC中NCOA4 m6A修饰水平与受照剂量也具有良好的量效关系。

最后，研究者利用多因素非线性回归模型构建了基于NCOA4/Ncoa4 m6A修饰水平的辐射暴露剂量预测模型，可前瞻性准确预测小鼠或人体吸收的辐射剂量。例如，该模型对于小鼠受照剂量的预测准确度高达96.6%，对于临床放疗患者的受照剂量预测准确度达到90.1%。总之，这项研究发现了多个基于RNA m6A修饰的候选辐射暴露标志物，并建立了基于这些修饰的人体辐射暴露剂量预测模型，证明了RNA m6A修饰在辐射受照人员医学分类和临床应用中的潜在可行性。

基于Ncoa4 m6A修饰水平的辐射暴露剂量预测模型

军事科学院军事医学研究院周钢桥研究员和卢一鸣副研究员为论文的共同通讯作者；军事科学院军事医学研究院陈红霞副研究员、赵曦博士和解放军总医院第一医学中心放射治疗科杨微主治医师为本文的共同第一作者。

为了进一步高效检测上述新发现的NCOA4 m6A修饰标志物，军事医学研究院周钢桥/卢一鸣团队与北京航空航天大学生物与医学工程学院常凌乾课题组合作，近日又在 Biosensors & Bioelectronics期刊上发表了题为“Sensitive, rapid detection of NCOA4-m6A towards precisely quantifying radiation dosage on a Cas13a-Microdroplet platform ”的研究论文。

该研究针对NCOA4 m6A修饰位点进行靶向设计，并基于CRISPR/Cas基因编辑技术设计了一种新型液滴微流控芯片系统（Cas13a-液滴微流控芯片平台）。在原理上，该 Cas13a-液滴微流控芯片平台可产生均匀的微液滴，每个液滴中包裹了NCOA4 m6A和CRISPR/Cas13a检测系统。其中，Cas13a可识别NCOA4 m6A修饰位点并进一步切割荧光报告分子，在20分钟内即可产生放大的荧光信号，通过计量阳性液滴数的比例即可实现直观的定量。此外，该平台可使反应体积从微升（μL）级减少到皮升（pL）级，从而能在比传统方法更低的靶标浓度下实现高度灵敏的定量检测。该平台的灵敏度和快速反应性在受照小鼠模型和临床放疗患者样本中都得到了验证。此外，与经典的实验室级别的m6A检测方法MeRIP-qPCR相比，该微流控芯片平台检测NCOA4 m6A的灵敏度增加了两倍。总之，军事医学研究院和北航两个团队跨学科合作开发的 Cas13a-液滴微流控芯片平台能够实现人体受照电离辐射剂量的快速、高灵敏度和高通量检测，为辐射暴露人员受照剂量的高通量测定和医学分类提供了全新的技术手段。

Cas13a-液滴微流控芯片平台通过检测NCOA4 m6A水平来确定辐射剂量的原理示意图

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