原创 微流体用于核酸富集、分离和无PCR检测中双孔二氧化硅纳米结构

样品制备芯片

为了量化纳米结构内的滑移速度和涡流强度，我们估计了扁平PET、PSNF和BSNF的涡度强度和平均速度分布（图3g-i）。速度剖面显示，PSNF表现出相当大的滑移速度和滑移长度（y截距）。然而，BSNF显示出高出10倍的滑移性能（（图3i）。BSNF上强大的滑移流也促使纳米结构内出现强烈的涡流，涡度强度为4.0×10−3 s−1（BSNF）和2.2×10−3 s−1（PSNF）。值得注意的是，图3j表明涡度强度预测了两个捕获测试的结果。此外，如果我们评估速度剖面在表面上的斜率，它与壁剪应力成正比，我们还可以估计纳米结构的滑移质量。BSNF 和 PSNF 的斜率 （~1） 比以前研究中提出的其他纳米结构（例如，大约 60）25 小得多，这可能是由于纳米结构包含具有最小固体分区的大空隙。

图4：BSNFs芯片上病原体和NA富集/分离的评估。

最后，我们执行了粒子接近测试，以直接可视化BSNF上的滑移流（图3k）。当我们在完美的滑移条件下以理想的无粘性流动将溶液中的 10 μm 荧光颗粒推向垂直排列的固体表面时，流线（或粒子轨迹）显示二维停滞流，在固体表面的中心有一个停滞点。虽然微尺度颗粒无法追踪纳米级多孔结构内部或正上方的流体流动，但它们可以定性地绘制流体流线和表面附近的边界层，这将根据表面的滑移长度和/或渗透率而改变。在这种情况下，裸PET上流速为零的防滑壁阻止了颗粒在膜附近流动，从而导致停滞点和表面附近出现荧光空位。然而，BSNF凭借其增强的滑移流量，可以将该距离降低到22.5μm（~61%），这表明目标可以更容易地接近并被BSNF捕获。

BSNFs芯片的病原体和NA富集/分离评估

图5：从BSNFs芯片中提取的SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度PCR检测

我们利用上述BSNF的增强捕获效率，使用BSNF芯片进行了富集和分离病原体和NA的实验。补充图 10 直观地描述了使用 BSNFs 芯片的病原体和 NA 富集/分离过程。在微通道内，使用ADH捕获带负电荷的病原体和NA并将其富集在芯片表面，随后使用高pH值（pH 10–11）洗脱缓冲液进行分离（补充图11）。通过采用ADH作为非离液性和同型双官能团的肼交联剂，BSNFs芯片消除了对离液剂的需求，从而防止了NA降解。我们最初评估了样品制备芯片定量逆转录PCR（qRT-PCR）的病原体和NA富集效率，并将这些结果与使用常规NA分离方法获得的结果进行了比较。图4a显示了常规方法（无富集分离）、两步法和一步法的示意图概述。与传统方法相比，两步法显示出更低的循环阈值 （Ct） 值，表明芯片有效地富集了病原体（图 4b）。此外，采用样品制备芯片的NA富集能力的1-Step方法显示出比2-Step方法更低的Ct值。此外，在两步法和一步法中，Ct值在Flat-、PSNFs-和BSNFs-芯片的顺序上呈下降趋势，这与表面结合效率的提高相关。值得注意的是，采用一步法的BSNFs芯片表现出卓越的捕获效率和几乎相同的绝对Ct值。

为了验证样品制备芯片在NA检测灵敏度方面的提高，我们评估了1-Step方法的LOD，使用HCT116细胞的连续稀释液进行细胞、基因组DNA和RNA富集，以及SARS-CoV-2培养液进行病毒和病毒RNA富集。样品制备芯片有效地将每个细胞和病毒样品浓缩从 1 ml 浓缩到最终体积 100 μl。这些特征导致通过平芯片处理的所有样品的 Ct 值较低，表明与传统方法相比，平芯片的 LOD 降低了 10 倍（图 4c-e）。此外，PSNFs和BSNFs芯片不仅通过纳米结构浓缩了病原体/NAs，而且富集了病原体/NAs，导致Ct值和LOD低于Flat-chip。这些差异可归因于以下因素：DNA稳健的双螺旋结构和RNA不稳定的单链结构之间的化学稳定性不同，与带正电荷的基团的差异静电偶联，以及qRT-PCR中RNA所需的额外逆转录步骤。在芯片制造后，通过SEM成像和FT-IR光谱在2周内确认了BSNFs芯片的稳定性。即使在用于病原体和 NA 富集/分离后，BSNFs-chip 的结构稳定性也得到了证实。这种鲁棒性使BSNFs芯片适用于一次性和可重复使用的应用。值得注意的是，该芯片在多次使用中表现出一致的性能，首次使用的 Ct 值为 27.78 ± 0.13，第二次使用的 Ct 值为 27.3 ± 0.35，第三次使用的 Ct 值为 27.03 ± 0.30，表明具有高重现性。这些结果进一步确立了BSNFs芯片作为传染病准确诊断的有前途的样品制备平台的地位，凸显了其作为传染病灵敏和精确诊断的可靠工具的潜力。

对SARS-CoV-2患者和健康人的临床样本中的RNA进行免PCR检测

为了应对SARS-CoV-2检测的复杂性和耗时的qRT-PCR的挑战，我们设计了一种基于纳米颗粒的LRET检测方法，作为一种快速和简化的替代方案。该测定利用能量供体和受体之间距离依赖性非辐射能量转移的原理，无需复杂的步骤即可进行靶标识别。我们设计了一种将一步法样品制备芯片和 LRET 检测相结合的策略，从而将 SARS-CoV-2 诊断的样本到答案时间从几个小时大幅缩短到一小时以内。该策略首先使用 BSNFs 芯片富集/分离病原体和 NA，然后使用 LRET 测定鉴定富集的靶 RNA，从样本收集到获得 SARS-CoV-2 检测结果的整个过程在 50 分钟内完成（图 5a）。LRET系统由核/活性壳/壳镧系元素掺杂的纳米颗粒和IRdye800组成。与靶位点互补的链是刺突（S）基因链的一部分，被分成两个半序列，然后在LRET供体（18 bp DNA）和受体（20 bp DNA）的表面上进行修饰。在 SARS-CoV-2 RNA 存在的情况下，互补对之间发生寡核苷酸杂交，使 LRET 供体和受体非常接近。该特性允许供体附近的受体在980 nm激发下通过LRET吸收供体的800 nm发射。相对强度随着靶RNA浓度的增加而增加，其计算为LRET供体的发光强度降低的比率。此外，LRET 供体和受体表面的 DNA 寡核苷酸可以特异性杂交到 SARS-CoV-2 RNA，与其他非靶标 NA 没有明显的交叉反应性。我们使用 1 pM 其他常见传染性呼吸道病毒的非靶序列验证了 LRET 测定的特异性。LRET 检测成功将 SARS-CoV-2 与人类冠状病毒 OC43 、hCoV-NL63、hCoV-229E 和甲型流感病毒 （IAV） 区分开来。

我们使用10 倍连续稀释的全长 SARS-CoV-2 基因组 RNA评估了 LRET 测定的分析灵敏度，范围为 10−1 至 104 PFU。相对强度与SARS-CoV-2 RNA的对数浓度呈线性关系，范围为10-1至10-3 PFU，相关系数（R2）为0.998（图5c）。所有样本的检测结果均与阴性对照组有统计学差异。根据标准曲线推导的方程，LOD估计为10−0.93 PFU。加入 103 个 PFU SARS-CoV-2 RNA 后，800 nm 发光寿命从 293 μs 猝灭到 265 μs，表明通过互补对之间的杂交，发生了从供体到受体的非辐射能量转移56。最后，我们使用 30 个鼻咽 （NP） 拭子样本测试了 LRET 测定与 BSNFs 芯片的临床适用性。对于通过qRT-PCR确定为阳性的患者样本，LRET检测与BSNFs芯片相结合也产生了阳性结果，p值<0.0001。然而，LRET测定与常规提取方法相结合，产生了大量的假阴性结果（图5d，e）。我们进行了受试者操作员特征 （ROC） 分析以检查诊断准确性，其中使用 BSNFs-chip 的 LRET 测定成功区分了 SARS-CoV-2 阳性和阴性样本，灵敏度为 100.0%，ROC 曲线下面积 （AUC） 值为 1（图 5f，g）。相比之下，LRET测定与常规方法相结合的灵敏度较低，为30.0%，AUC值为0.597。这些结果表明，通过将快速诊断系统与基于BSNFs芯片的样品制备相结合，用于病原体/NA富集，具有无PCR检测传染病的潜力。

我们开发了BSNFs芯片，这是一种具有双孔纳米结构的样品制备芯片，可协同增加表面积和表面滑移流的优点。BSNFs芯片由成本低于1美元的PET薄膜制成，是一种具有成本效益的策略，封闭式系统降低了交叉污染的风险。我们通过模拟和实验对潜在机制进行了深入研究，证明了小孔隙和大孔隙在增加BSNFs表面积和滑移流方面的贡献，甚至可以诱导纳米涡旋，从而实现更好的NA隔离。基于通过模拟和实验验证的BSNFs芯片的高结合概率，我们评估了其使用基于PCR的方法富集病原体和NAs的有效性。与传统提取方法相比，BSNFs芯片的LOD降低了100倍，这对于有效的传染病检测至关重要，尤其是在低病原体水平下。虽然单独基于LRET的检测的灵敏度低于基于PCR的方法，但一步法样品富集系统和LRET检测的集成可以成功区分SARS-CoV-2阳性和阴性样本，灵敏度为100.0%。我们的无PCR传感方法将精心设计的样品制备系统与检测系统相结合，为高效、灵敏地诊断传染病铺平了道路。未来的研究将侧重于通过探索胶束聚集机制和精确的孔隙控制来扩展这些纳米材料的适用性，包括设计定制的纳米结构，同时旨在加强 BSNFs 芯片与 LRET 检测的集成，以将其综合效用从 SARS-CoV-2 检测扩展到更广泛的病原体。我们预计，这种方法将在未来几年内在推进传染病快速灵敏诊断方法领域发挥重要作用。

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