原创 单细胞液滴和水凝胶的生物医学应用

单细胞异质性在生理学、肿瘤学、神经生物学、临床诊断和治疗等各个生物医学领域都得到了强调。先前微流控策略的方法学发展已经实现了动态单细胞操作、监测和分析。由于其高通量、可控尺寸和独立成分的使用，微流控液滴技术作为生物医学应用中基于细胞的高通量分析工具，如蛋白水解活性检测、细胞因子分泌、和基因测序，引起了极大的关注。在这里，我们回顾了过去六年中在生物医学领域引入的单细胞液滴应用，包括小分子检测、蛋白质分析、药物筛选分析和遗传分析。

单细胞小分子检测

在单细胞分析中检测小分子是更好地了解生物体、探索细胞异质性和早期诊断疾病的必要策略。细胞间小分子物质，如乳酸和活性氧，广泛参与细胞的信号通路，在许多生理和病理过程中起着重要作用。例如，癌症的一个显著特征是高葡萄糖代谢和乳酸生成。癌症细胞通过有氧糖酵解将葡萄糖转化为乳酸，这在细胞信号激活、增殖和疾病进展中起着重要作用。单细胞液滴微流体最近被应用于检测这些小分子。Mongersun等人提出了一种液滴微流体方法，其中使用被动力将液滴包封的细胞放置到阵列中。该方法可以快速定量地确定许多单细胞中乳酸的释放。通过使用商业乳酸试剂盒将乳酸转化为荧光产品，单细胞中乳酸盐的释放速率由液滴荧光的增加决定。基于这种方法，他们开发了一种方法来确定K562白血病和U87胶质母细胞瘤细胞在化学抑制乳酸流出条件下乳酸释放的细胞间差异，这为研究高度异质性的细胞群提供了一种新工具。Scoles小组在同一年使用带有T连接通道的微流控液滴装置也证明了转移患者单个循环肿瘤细胞（CTC）中乳酸的荧光检测。他们从20万个血细胞中检测到了10个肿瘤细胞。这项工作为涉及代谢的单一CTC识别提供了概念验证。

最近，徐的团队开发了一种表面增强拉曼散射（SERS）-微流控液滴平台，通过由银纳米粒子修饰的Fe3O4磁性微球组成的多功能磁性SERS底物，在单细胞水平上实现了多重代谢物的无标记同时分析（图6A）。他们实现了三种单细胞代谢物的无标签、无损、同时测定：丙酮酸、三磷酸腺苷和乳酸。他们的金属磁性复合基质可用于实现单细胞代谢物的有效吸附和从复杂基质中的快速分离，并且具有很高的SERS灵敏度，使SERS微滴平台成为在代谢水平上探索单细胞异质性的有力工具。单细胞液滴也可以根据小分子动力学进行分类。Zielke等人开发了一种液滴微流体装置，用于基于糖酵解分离癌症细胞亚群，这种方法不需要使用标记物或活性分选成分。他们的技术用于控制特定表面活性剂环境下癌症乳腺细胞糖酵解过程中质子的分泌，以降低液滴的pH值。随着液滴pH值的降低，液滴的界面张力增加，使不同糖酵解水平的细胞能够分离。由于癌症细胞暴露在不同的氧气和营养环境中，它们的糖酵解反应不同。该方法可用于根据选定的代谢差异将癌症细胞与正常细胞分离，并鉴定具有相似物理特征的细胞。

细胞内活性氧，如超氧阴离子和过氧化氢（H2O2），参与免疫系统的调节、细胞生长和迁移、代谢调节、重要生物物质合成和其他生理过程。刘的团队开发了一种高灵敏度的液滴微流体方法，用于定量测定不同类型的单细胞与金纳米簇结合分泌的H2O2（图6B）。单细胞分泌的130 H2O2可以诱导辣根过氧化物修饰的金纳米簇发生显著的荧光变化。他们的研究结果表明，快速生长的癌症细胞可以产生比正常细胞系具有更高H2O2含量的分泌物，这为研究单细胞水平上H2O2分泌的细胞间差异提供了有用的工具。

抗坏血酸（AA），也称为维生素C，是一种强抗氧化剂和酶反应中的辅因子，可以预防自由基诱导的疾病，特别是帕金森病和癌症。AA可以有效地清除与多种形式的组织损伤和疾病相关的有毒自由基和其他活性氧，这有助于开发简单、快速和简单的分析方法，用于高度选择性和可靠地测量AA。最近，Alizadeh等人报道了一种液滴微流体方法，用于活细胞中AA的细胞内成像（图6C）。通过分离小微滴，他们能够快速检测和成像单个细胞中的AA。他们的传感系统基于非氧化还原策略，其中应用了荧光聚合物纳米复合材料。他们的技术为研究单细胞提供了一种稳健的方法和理想的平台，并为临床评估中的分子传导生物学检测提供了一个有前景的新工具。

4.2单细胞蛋白质分析

蛋白质是一种在活细胞中具有特定功能的生物大分子，与细胞行为和代谢的特异性直接相关。不同细胞中表达的蛋白质具有明显的异质性，单个细胞内有许多类型的蛋白质。尽管蛋白质类型丰富，但具有重要功能的蛋白质数量非常少。因此，基于单细胞的特异性蛋白质的定量分析对于揭示群体中细胞的异质性以改善由单细胞或一小组细胞引起的疾病（如癌症）的早期诊断是非常重要的。流式细胞术是经典的单细胞蛋白分析方法，可以通过免疫标记各种功能蛋白来检测特定功能蛋白的含量。然而，由于分泌蛋白的丰度低、缺乏足够的灵敏度和细胞固定的要求，基于传统流式细胞仪对单细胞分泌的特定蛋白进行动态检测和分析仍然具有挑战性。微液滴技术因其体积小、检测灵敏度高、通量大，在单细胞蛋白质分析中具有广阔的应用前景。在下文中，我们讨论了单细胞分泌的酶和细胞因子等蛋白质的定量分析，以表达细胞群的异质性。

在肿瘤转移过程中，恶性肿瘤细胞突破周围的生理屏障并迁移。肿瘤细胞和免疫细胞在体内具有不同的迁移能力。基质金属蛋白酶（MMPs）等分泌产物代表了有前景的药物靶点和候选生物标志物，并为评估癌症转移提供了有价值的信息，并基于对其活性的分析，允许筛选新的药物来调节炎症反应和肿瘤发生。 Yu等人报道了一种微流体方法，用于使用流动聚焦毛细管微流体设备检测单个肿瘤细胞液滴中MMP9（MMPs的明胶酶亚群）酶活性（图7A）。细胞分泌的MMP9能够切割一对荧光团/猝灭分子（FITC和DABCYL）修饰的肽。这可用于测量微滴中MMP9酶在荧光强度方面的活性，从而能够以高再现性定量分析单个癌症细胞分泌的MMP9的蛋白水解活性，以评估癌症细胞的侵袭功能。该方法在检测细胞侵袭性方面的超高灵敏度使其适用于细胞诊断和癌症研究的高通量筛选。然而，由于载体油的流动性，现有的基于液滴的单细胞基质金属蛋白酶（MMP）分析方法很少能够连续跟踪液滴的蛋白水解含量。为了改善这一点，Mu的团队描述了使用热固性油通过一个过程实时监测液滴的MMP分析，在这个过程中，液滴在形成后通过转化为固体而固定（图7B）。这种方法可以实时监测单细胞蛋白水解活性，而不会损害液滴微流体的灵活性，从而可以根据实时荧光曲线计算反应速率。该过程揭示的MMP活性的明显细胞异质性表明其在其他类型的基于细胞的高分辨率动态信息分析中的应用潜力。

哺乳动物细胞（如免疫细胞、内皮细胞和癌症细胞）分泌的细胞因子在感染、免疫反应、炎症和疾病发展中起着关键作用。特别是，细胞因子表达的增加与肿瘤血管形成和生长有关，这反过来可以产生新的肿瘤血管并扩增现有的肿瘤血管。Hsu等人建立了一种微流体液滴系统，用于高灵敏度的单细胞多重分泌组分析。和单核细胞趋化蛋白-1。该系统还可以在60分钟内测定6000个细胞的细胞分泌物的显著异质性。此外，徐的小组建立了SERS液滴微流体平台，用于快速、超敏和同时检测单个癌症细胞分泌的细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）和IL-8（图7C）。他们的结果表明，细胞与细胞的相互作用可以通过上调VEGF和IL-8来促进癌症细胞的血管生成。这种方法的高灵敏度源于金属等离子体增强和磁场诱导聚集的放大效应，这使得含有单个细胞和四个免疫颗粒的油滴中形成高通量的水包水成为可能。此外，可以根据不同的排泄能力进行细胞分选，以探索单细胞释放细胞因子的细胞间异质性。这项技术为理解各种细胞因子在肿瘤血管化和侵袭性肿瘤生长中的生物学作用提供了一种新方法。最近，Wimmers等人提出了一种微流体单细胞液滴系统，用于免疫荧光检测人浆细胞样树突状细胞（pDC）中I型干扰素（IFN）的产生。I型IFN是与感染和癌症相关的免疫的关键细胞因子。他们的结果支持I型干扰素的产生仅限于少量单独刺激的pDCs，并表明pDC驱动的I型干扰素产生存在随机差异。此外，袁等人使用微流体装置将单个自然杀伤NK-92 MI细胞及其K562靶细胞快速包封到微滴中，以提高单个细胞分泌IFN-γ的能力。微滴包封可以防止分泌物扩散到相邻细胞，并显著降低非微流体微滴方法下获得的假阳性和阴性率。

免责声明:文章来源汶颢www.whchip.com以传播知识、有益学习和研究为宗旨。转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除。