原创 生物芯片的技术核心（下）

4、探针的制备技术

探针（探针的功能是识别靶序列和携带报告分子，如同位素、荧光、地高辛等）：为了提高监测灵敏度，人们的努力放在信号放大以及模板扩增两个方面，其中应用经过特殊处理的探针方法可以提高灵敏度的方法有三种：分支探针这种方法的原理是，设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针，分支末端以酶标记。这样，经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。分子信标（Molecular beacon, MB，一种设计巧妙的荧光标记的核酸探针，未杂交状态下为发夹结构，在发夹的两端分别连接荧光素分子和猝灭分子，利用荧光共振能量转移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺键为骨架，不带电荷，为DNA类似物。与DNA的亲和性高、酶解稳定性好，因此多用来做诊断和检测用探针）探针3项技术。

5、杂交反应及过程控制技术

芯片杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步。杂交时选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的最大多数处于最佳状态中，也就是说要使得尽可能多的正确配对物都不遗漏（假阴性尽可能少），有错配的杂交降低至最低（假阳性尽量少），这是非常难以达到的境界。目前杂交是提高芯片在实际应用中的准确性的关键步骤之一。杂交条件的构建要根据芯片的实际情况进行最优化。

杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：（1）寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。（2）支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍。（3）杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些；而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。（4）GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。（5）探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。（6）核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。

6、杂交图谱的信号检测技术

杂交图谱的信号检测是生物芯片的两个关键技术之一，目前关于芯片的大量专利和研究集中在这方面。荧光检测主要有2种：激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高，但扫描时间长；后者扫描时间短，但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用，但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号，而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的，还是单个或2个碱基的错配产生的，或者兼而有之，甚或是由非特异性吸附产生的，因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记，建立新的检测系统，以提高杂交信号检测的灵敏度。

比较成熟的是采用激光系统扫描仪进行的荧光检测，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量扫描仪工作质量的几个重要指标。由于荧光标记法的灵敏度相对较低，因此质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等正作为新的芯片标记和检测方法处于研究和试验阶段，其中最有前途的当推质谱法。

目前有很多厂商生产生物芯片信号检测扫描仪，知名的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic âMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000年GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。

7、信号（信息）分析与解读——数据分析

芯片杂交图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理团建、数据提取（mining）或统计分析软件，芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析和积累。

从国际上生物芯片专利的按领域分布来看，62%的专利集中在数据分析领域，可见如何对生物芯片带来的海量数据进行解读、分析是生物芯片研究领域的焦点和重点。

对所读取的数据的处理方面，目前已经有许多数学统计的方法用于芯片数据处理与信息提取，应用最广泛的是聚类分析（cluster analysis）、此外还有主成分分析(principal component analysis)、时间序列分析(time series analysis)等，但是还没有一种最标准的统计方式。

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