原创 基于微流控芯片的核酸适配体筛选技术研究进展上

摘 要 适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术( SELEX)筛选得到的,可与靶标分子以高亲和力特异性结合的单链 DNA 或 RNA,在生物分离分析、临床诊断和疾病靶向治疗等领域应用广泛。 适配体的发展与筛选技术的进步密切相关,以 SELEX 为基础,研究者开发了磁珠 SELEX 和毛细管电泳 SELEX 等多种适配体体外筛选技术,但这些方法存在筛选轮次多、筛选周期长和样品消耗量大、对小分子筛选效率低等缺点。 微流控芯片具有体积小、高通量和易集成等特点,基于微流控芯片的 SELEX 技术在一定程度上可解决上述问题,实现适配体快速、高通量的体外筛选。 本文在总结 SELEX 及其关键技术要点的基础上,重点评述了基于微流控和微阵列芯片 SELEX 技术的研究进展,并对 SELEX 技术中未来的发展方向进行了总结和展望。

适配体 是 通 过 指 数 富 集 的 配 体 系 统 进 化 技 术 ( Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)在体外筛选得到的一段寡聚核糖核苷酸(RNA)或单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)序列,与靶标分子之间具有特异性相互作用,借助范德华力、氢键、疏水作用和静电作用等分子间作用力,折叠成复杂稳定的 3D 结构,如茎环、发夹和 G 四链体等。自 1990 年 Ellington和 Tuerk从含有 1015种寡核苷酸文库中筛选出 RNA 适配体以来,研究者陆续筛选出许多适配体,其靶标范围覆盖了金属离子、三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸等小分子物质; 生长因子和细胞粘附分子等蛋白质以及其它大分子有机物,甚至可通过靶向特定的膜蛋白识别病毒、细菌和细胞。 目前,适配体已被广泛用于靶向药物递送、生物分子识别和检测等领域,并已尝试用于临床治疗方面。

适配体与靶标分子的亲和力可达 mmol / L ~ pmol / L 级别,与抗体水平相当。 适配体具有抗体不能比拟的优势,如更高的选择性和稳定性、制备简单、易修饰、无免疫原性等,因此受到研究者关注。

适配体的发展与筛选技术的进步密切相关。 研究者根据 SELEX 的关键技术要点对传统筛选技术进行了改良,如依据结合与未结合寡核苷酸的分离技术,提出了基于磁珠分离法的 SELEX 技术和基于毛细管电泳分离法的 SELEX 技术等;提出了基于不对称 PCR 法、入核酸外切酶法和磁珠法的次级文库制备技术。 但是,SELEX 技术仍存在筛选轮次多、筛选周期长、文库合成量大、利用率低、样品消耗量大等问题。 微流控芯片具有体积小、高通量和易集成等特点,基于微流控芯片的 SELEX 技术在一定程度上可解决上述问题,为实现适配体快速、高通量的体外筛选提供了新思路。本文依据近年来适配体筛选技术的研究进展,在总结 SELEX 及其关键技术要点的基础之上,重点评述了基于微流控芯片和微阵列芯片 SELEX 技术的研究进展。

微流控芯片概念及特点

微流控芯片又称为微全分析系统,是由 Manz 等在 20 世纪 90 年代首次提出并发展起来的跨学科分析技术。 通过微加工技术,在硅、玻璃或有机聚合物基质上构建流体微通道、反应微腔室和储液池等微结构单元,将分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析全过程。 微流控芯片具有集成化、小型化、自动化等特点,以及样品和试剂消耗量少、反应速度快、可大量平行处理等优点,在生物、化学和医学等领域表现出巨大的发展潜力。 目前,微流控芯片技术已被广泛用于细胞培养、基因扩增与分析和蛋白质检测等领域。

基于微流控芯片的 SELEX 技术是近年发展起来的一种快速高效的适配体筛选体系。 将微流控芯片与 SELEX 技术结合,可将样品和试剂的消耗量降至微升级,大大降低了筛选成本, 提升了分析速度和准确性。 目前,已发展的微流控芯片 SELEX 技术主要包括磁珠法和溶胶-凝胶法等。

微流控芯片 SELEX 技术筛选适配体

基于磁珠的微流控 SELEX 技术 基于磁珠的微流控 SELEX 技术主要包括连续流磁激活分离芯片(Continuous-flow magnetic activated chip-based separation, CMACS) 系统和微磁分离(Micro magnetseparation, MMS)系统。

Soh 研究组 利用 CMACS 系统,通过芯片连续流磁分离对重组 A 型肉毒杆菌神经毒素轻链的适配体进行筛选(图 1)。 首先,通过 PCR 扩增制备 DNA 文库,并通过 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)介导法将靶标分子固定在磁珠上; 然后,将 DNA 文库与固定有靶标分子的磁珠共同孵育,在CMACS 芯片上进行连续洗涤; 最后,用生物素化的反义引物进行 PCR 扩增,通过磁珠法制备次级文库,并测定其亲和力。

图 1 基于连续连续流磁激活芯片(CMACS)系统的 SELEX 过程示意图

然而,CMACS 系统使用过程会出现微气泡导致的气流扭曲,以及微通道阻塞导致的磁珠聚集等问题,影响适配体的纯度和回收率。 在后续的研究中,Soh 研究组开发了 MMS 系统(图 2),将铁磁材料整合到微通道中,通过芯片中镍材料和缓冲液间磁导率的相对差异,实现对通道内流体动力和磁致动力的精确控制,减少了磁珠和适配体候选物的损失,实现了较高的分子分配效率。

图 2 基于微磁分离系统的 SELEX 过程示意图

Huang 等在 MMS 芯片的基础上,将反应池、分离通道和微加热系统整合到一块芯片上,成功筛选出 C 反应蛋白的适配体,与传统 SELEX 技术相比,基于微流控芯片的 SELEX 技术在单轮筛选时间和样品消耗量上均大大降低。

Ahmad 等利用 MMS 芯片高效的捕获能力和可高流速洗涤的特点,成功筛选出 3 种蛋白质的适配体:人血小板衍生生长因子 BB(Kd = 0. 028 nmol / L)、凝血酶(Kd = 0. 33 nmol / L)和载脂蛋白 E3(Kd =3. 1 nmol / L)。 通过低浓度蛋白筛选和高流速、长时间洗涤,降低了非特异性吸附和弱结合的情况,获得了与文献不同的人血小板衍生生长因子 BB 和凝血酶的适配体序列,而且亲和力也有了较大程度的提升。研究人员还发现适配体的亲和力受蛋白质带电状态的影响,由人血小板衍生生长因子 BB在不同 pH 条件下的筛选结果发现,在酸性缓冲液中,其与适配体具有更高的亲和力。

Stoltenburg 等使用常规磁珠 SELEX 技术经 13 轮筛选得到链霉亲和素的适配体,其解离常数约为 56 ~ 86 nmol / L。 而使用 MMS 系统经 3 轮分离后即得到了解离常数在 25 ~ 65 nmol / L 之间的适配体。 由此可见,基于微流控芯片的微磁分离 SELEX 技术比常规的磁珠 SELEX 技术更高效。

基于溶胶-凝胶的微流控 SELEX 技术

溶胶-凝胶是用含高化学活性的化合物作为前体,在液相下均匀混合并进行水解、缩合等反应,形成稳定的透明溶胶体系,经过胶粒间缓慢聚合,形成三维空间网络结构的凝胶。 凝胶经过干燥、烧结、固化,制备出纳米乃至亚纳米结构的材料。通过溶胶-凝胶及其衍生物材料固定蛋白质,无需亲和试剂标记,加入硅酸盐可最大程度地保持蛋白质的生物活性,且可长期保存不失活。 此外,溶胶-凝胶材料价格相对便宜,与芯片底板材料性质相近,具有极好的相容性。 这些特点为溶胶-凝胶在微流控芯片上的应用和这一类型芯片的大规模生产奠定了基础。

基于溶胶-凝胶的微流控 SELEX 技术中,靶标分子包裹于具有多孔纳米结构的硅酸盐水凝胶中,寡核苷酸进入纳米孔与靶标分子结合。 因此,溶胶-凝胶颗粒的加工工艺极为关键。 首先,溶胶-凝胶基质中纳米孔结构的尺寸必须与靶标分子匹配; 其次,溶胶-凝胶颗粒须在点样后长时间稳定存在,并且有足够强的粘附力,以防洗涤过程中颗粒丢失; 最后,每个颗粒的形态与尺寸必须统一,这对采用计算机自动分析实验结果至关重要。

Ahn 等在芯片上集成溶胶-凝胶腔室和微加热器等结构单元,用于文库的洗脱和筛选(图 3)。 该芯片带有一组铝电极、5 个相连的六边形腔室和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)微通道,各腔室靶标分子竞争性结合寡核苷酸链。 每个腔室内单个溶胶-凝胶颗粒的体积约为 7 nL,每个颗粒可容纳 30 fmol 蛋白质。 将该技术用于酵母 TATA 结合蛋白和几种同源蛋白质的适配体筛选,仅经过 6 轮筛选, 得到了解离常数为 2. 7 nmol / L 的 TATA 结合蛋白的适配体。

图 3 基于溶胶-凝胶的微流控芯片 SELEX 技术原理示意图A) 溶胶-凝胶微流体装置的尺寸;(B)SELEX-on-a-chip 设备的总体示意图

小分子适配体的体外筛选工作极具挑战性,一是因为小分子难以固定; 二是受小分子本身结合位点数的限制,筛选出的适配体与小分子的结合也会受到影响。 通过改变溶胶-凝胶颗粒孔径的尺寸,可很好地实现小分子靶标的固定。 Bae 等加工了具有纳米孔径和微米通道的溶胶-凝胶颗粒,寡核苷酸可在微米通道内自由移动,但与小分子靶标相互作用后,被截留在溶胶-凝胶颗粒中。 通过基于溶胶-凝胶法的微流控 SELEX 技术,采用 7 轮筛选得到了黄嘌呤的适配体,解离常数为 4. 2 滋mol / L。

微流控芯片与 SELEX 技术结合,提高了适配体的筛选效率,降低了筛选成本。 但是,基于微流控芯片的适配体筛选技术在流体流动过程中常会产生气泡,对靶标分子与适配体的识别,以及后续的PCR 扩增等均会产生影响。

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