原创 基于流动聚焦微流控芯片的液晶微滴制备及传感响应分析

摘 要 针对限制液晶微滴生物传感响应性能的微滴尺寸不均一的问题,设计了流动聚焦微流控芯片结构,系统研究了单分散液晶微滴光学探针的制备方法及传感响应特性。 以向列型液晶为分散相,十二烷基硫酸钠/ 聚乙烯醇混合液为连续相,通过控制流动聚焦时两相流速来调节影响液晶微滴生成的不同流动模式。 测试并分析了两相流速、 连续相粘度、 孔口宽度等参数对液晶微滴尺寸的影响及其内在机制。 利用不同尺寸的液晶微滴为传感探针,检测并分析了肝肠疾病的潜在标志物脱氧胆酸。 结果表明,当液晶微滴尺寸从38μm增加到 77 μm时,脱氧胆酸的检出限从(383±23.6) μmol / L降低到(140 ± 14.1) μmol / L。

液晶是一种对外界刺激响应灵敏的软材料,液晶微滴表面积/ 体积比大、 响应迅速、 灵敏度高,在生物传感领域具有良好的应用前景。 采用双亲性分子修饰液晶微滴可制备光学探针,待测物在微滴表面与修饰物的相互作用会引起微滴中液晶分子取向改变。 借助液晶的双折射特性,很容易在偏光显微镜下观察到此变化,从而将分子间的相互作用转换为宏观可见的光学信号,实现生化分子的传感检测。 在液晶微滴表面修饰特定靶分子,通过偏光显微镜观测和记录待测物与之相互作用引起的液晶分子取向的转变过程,已实现了有机磷农药、 重金属离子、 蛋白质、 葡萄糖和胆汁酸等的传感检测。 研究表明,表面锚定和微滴尺寸是决定液晶微滴中液晶分子取向的重要因素,特别是微滴尺寸对传感性能有极大影响。

常用的超声分散法制备的液晶微滴尺寸均匀性不佳,基于此的液晶微滴光学探针的传感响应稳定性和一致性都不理想,限制了其在生物传感领域的进一步应用。 因此,尺寸均一的液晶微滴的制备成为获得准确定量传感响应信号的前提,很多研究者进行了不同尝试,如 Gupta 等采用二氧化硅微球模板法制备了单分散液晶微滴,然而,其使用的氢氟酸腐蚀性很强且实验操作复杂。 近年来,随着微流控技术的发展,能实现液滴精确操控的液滴微流控技术为高效稳定制备单分散液晶微滴提供了重要手段。 用于液滴制备的流动聚焦微芯片结构因其控制性和稳定性优异而备受关注。 基于流动聚焦结构, Bao 等以脂质分子为连续相,液晶分子为分散相,制备了直径(16.7±0.2) μm 的脂质修饰液晶微滴,在偏光显微镜下观察由抗菌肽与液晶微滴表面脂质分子的相互作用引起的液晶分子取向变化,实现了对抗菌肽的传感检测。 Khan 等利用流动聚焦结构,以向列型液晶分子 4-氰基-4′-戊基联苯(5CB)为分散相,嵌段共聚物高分子为连续相,制备了尺寸单分散嵌段共聚物修饰的液晶微滴,观察液晶微滴在不同pH值条件下构型的变化,实现了pH值检测。 虽然基于流动聚焦结构的单分散微滴制备已被广泛研究,但由于不同液滴制备所需分散相材料不同,流动模式及参数条件也不尽相同,很难直接移植到单分散液晶微滴制备中。 在基于流动聚焦结构的单分散液晶微滴制备中,不同参数对微滴尺寸及稳定性的影响也鲜有报道。

在流动聚焦结构中,连续相流体在两相流交汇处挤压分散相流体,由于界面张力引起流体失稳,进而在粘性力等的作用下夹断分散相流体形成微滴。 已有研究表明,通道的几何结构、 流体流速和流体性质等对流动聚焦结构中微滴生成特性有重要影响。 本研究利用液滴微流控技术,基于流动聚焦微结构,以常用于液晶生物传感器制备的向列型液晶分子 5CB 为分散相,常用于液晶微滴光学探针修饰的双亲性分子十二烷基硫酸钠为连续相,系统研究了两相流体流速、 连续相粘度以及微通道交汇处狭窄部分孔口尺寸等参数对液晶微滴生成的影响,建立了单分散液晶微滴光学探针的制备方法。 最后,将制得的不同尺寸单分散液晶微滴光学探针用于肝肠疾病潜在标志物脱氧胆酸的初步检测研究,探究了微滴尺寸对检测性能的影响。

实验仪器与试剂

URE-2000 / 25 紫外光刻机；微注射泵；数显鼓风干燥箱；等离子清洗仪；真空干燥箱；水浴锅；电子天平；偏光显微镜。

负性光刻胶 SU-8 3050； 聚二甲基硅氧烷及固化剂( PDMS, Sylgard184); 乙醇(75%); 聚二甲基二烯丙基氯化铵、 聚苯乙烯磺酸钠; 聚乙烯醇; 4-氰基-4′-戊基联苯; 脱氧胆酸; 磷酸盐缓冲液。 实验用水为 Milli-Q 系统制得的超纯水。

芯片设计及制备

本研究用于制备单分散液晶微滴的流动聚焦微结构如图 1A 所示。 微结构中通道宽度为 125 μm,连续相和分散相交汇处狭窄孔口长度为 60 μm,通道深度为 50 μm。 芯片加工采用传统软光刻技术。首先,将 PDMS 预聚体与固化剂按质量比 10 ∶ 1 混合均匀,抽真空 30 min 以消除气泡。 然后,将得到的PDMS 混合物旋涂于 SU-8 阳模上, 80 ℃固化 30 min,得到 PDMS 图案层。 将 PDMS 图案层从模具上剥离,用打孔器在进口和出口位置打孔。 利用氧等离子体对 PDMS 图案层及洗净的载玻片处理 3 min 后,将其粘合在一起。 最后,将键合好的芯片置于 150 ℃热板上插管、 封胶, 3 min 后取下,冷却至室温,得到实验用芯片(图 1B)。

图 1 流动聚焦微流控芯片结构示意图(A)和芯片实物图(B)

实验方法

1. 微通道表面修饰

利用聚电解质层层自组装方法对微通道壁进行表面修饰。 由于氧等离子体处理可将微结构表面在一定时间内保持活化状态,在 PDMS 图案层与载玻片键合后,立即将带正电荷的 PDADMAC、 水和带负电荷的 PSS 聚电解质溶液以 1100 μL / h 的流速依次通入微通道中,并保持 30 min。 最后,将修饰后的微通道充满水,待用。

2.单分散液晶微滴制备

利用聚焦流微通道,以 5CB 作为分散相,以含有 5 mmol / L SDS 的 PVA 溶液作为连续相,通过注射泵调节两相流体的流速,以调控液晶微滴的生成。 采用不同浓度 PVA 溶液调节连续相粘度,并利用显微摄像系统实时观察记录1. 3. 3 DCA 的检测。利用 PBS 缓冲液配制 DCA 待测液。 分别取 10 μL 不同尺寸的液晶微滴悬液于洗净的载玻片上,然后滴加一定浓度的 DCA 溶液。 在偏光显微镜下观察加入 DCA 后液晶微滴的构型变化。

结果与讨论

1. 微通道润湿性对液晶微滴生成的影响

连续相对通道壁良好的润湿性是微滴稳定产生的前提。为了制备W/ O型液晶微滴,需要对PDMS 微通道壁进行亲水处理。 当采用表面未修饰的微通道制备液晶微滴时,发现液晶微滴难以稳定生成(图2A)。 借助液晶的双折射特性,可在偏光显微镜下观察到分散相在通道中的分布情况。 图 2B为表面未修饰的微通道中生成液晶微滴的偏光显微镜图像,可以明显观察到作为分散相的 5CB 粘附在通道壁上,无法稳定生成微滴。主要原因是键合时经氧等离子体处理的微通道仅具有短暂亲水性,随着时间推移,微通道表面会逐渐恢复疏水性从而影响液晶微滴的稳定生成。 研究表明,利用层层自组装技术将聚电解质通过静电相互作用修饰氧等离子体处理的微通道壁, 可使其具有持久亲水性。 图2C和2D为PDADMAC / PSS 修饰的微通道中制备液晶微滴。以8和40 μL / h的速度将5CB和SDS / PVA 溶液分别注入通道后,通道中形成了尺寸均一的液晶微滴。 微滴在偏光显微镜下为十字状(图 2E),明场下中心有明显缺陷(图 2F),表明其为“射线型”构型。 这是由于在微滴形成过程中,连续相中的 SDS 在 5CB 表面吸附,将疏水性烷基链伸入液晶相中,引起 5CB 分子呈现出垂直微滴表面的排列。 但是,仅使用 SDS 溶液作为连续相制备的液晶微滴稳定性差。 加入的 PVA 可包裹在微滴表面,促进 SDS 在微滴表面吸附,从而增加液晶微滴的稳定性(图 2G)。

图 2 明场(A、 C)和偏光场(B、 D)下未经表面修饰(A、 B)和经过表面修饰(C、 D)的流动聚焦微通道制备液晶微滴的显微图像; 所生成的液晶微滴在(E)偏光和(F)明场下的显微图像; (G)生成的液晶微滴构型示意图

2. 流体流速对液晶微滴生成的影响

改变连续相和分散相流速,可以观察到微通道中液晶微滴生成时存在 4 种流型(图 3)。 通常,分散相流体被剪断生成微滴的过程受剪切力和界面张力等因素的影响,其相互关联成为表征微通道内流体状态的无量纲参数,如雷诺数 Re和毛细管数 Ca。 当连续相和分散相流量都较小时,如连续相流量 Qc= 40 μL / h,分散相流量 Qd= 35 μL / h,液晶微滴在微通道中的流型为挤压型(图 3A和 3B)。 分散相首先向下游延展,界面逐渐生长并阻塞孔口,从而增加上游压力,使得连续相开始挤压界面形成颈缩,并最终剪断分散相。 在连续相剪断分散相之前,由于通道宽度大于孔口宽度,使得分散相流过孔口后压力降低,速度随之降低,导致上游高流速的分散相在下游低流速区域累积从而体积逐渐增大,生成的液晶微滴在通道内为棒状而非球状。 此流型下连续相毛细管数 Cac较低,粘性力不足以剪断微滴,通道结构对微滴生成起主要作用。随着 Qc 增大, Cac 随之增大。 当Qc= 300 μL / h, Qd= 3 μL / h 时, Cac(Cac>0.01)较大,高流速使得分散相无法填满整个孔口区域,从而使流型从挤压流变为滴流(图3C和3D)。 此时,分散相前端延伸并保持在两相管道交汇处, Rayleigh毛细不稳定性是液晶脱离分散相形成微滴的主要作用力。提高任意一相的流速均可引起液晶微滴流型的转变。 当保持 Qc 不变,增大 Qd 时,流型可从滴流变为射流(图3E和3F)。 由于对流不稳定性,液晶微滴一般在下游生成。 当分散相的惯性力和连续相的剪切力足以克服界面张力时,分散相在达到液晶微滴断裂脱落所需临界值前被拖向下游,伴随有卫星液滴产生。当Qd与Qc均较大且相近时, Cac与Red均较大(Cac>0.01, Red>0.02)。此时分散相在整个通道上拉长变为管状流,无微滴生成(图3G和3H)。 将 Qd 和 Qc 分别控制在 3 ~ 60 μL / h和100 ~ 1000μL / h范围内可生成稳定均一的液晶微滴。

图 3 明场(A、 C、 E、 G)和偏光场(B、 D、 F、 H)下不同流速所生成的流型图: (A、 B)挤压流; (C、 D)滴流; (E、 F)射流; (G、 H)管状流; 比例尺为 200 μm

图 4 不同流速下制备的液晶微滴在偏光(A、 C、 E)和明场(B、 D、 F)下的显微图像。 比例尺为 100 μm

图 5 (A)连续相流量为 200 μL/ h 时,微滴尺寸与分散相流量的关系; (B)分散相流量为 30 μL/ h 时,微滴尺寸与连续流量的关系

连续相粘度对液晶微滴生成的影响

连续相粘度会通过影响毛细管数 Cac 对生成微滴尺寸产生影响,可采用不同浓度PVA 调控连续相粘度。 当连续相和分散相的流量分别为 200 μL / h和 16 μL / h时,不同 PVA 浓度下所生成液晶微滴尺寸的变化如图6A 所示,随着 PVA 浓度增加,连续相粘度增加, Cac 增大,分散相受到连续相的粘性剪切力增大,使得液晶微滴生成尺寸减小。当PVA含 量从0增加到1%时,微滴尺寸从(102±1.05) μm缓慢减小为(97±1 98) μm。当PVA含量从1%增加到 2.5% 时,微滴尺寸陡降到(36±1.25) μm。 PVA含量不高于1%时,微滴生成流型为射流; 当PVA含量高于2.5%时,微滴生成流型为滴流。滴流下生成的液晶微滴尺寸明显小于射流,表明可以通过调控连续相粘度调控流型,从而在更大范围内调控生成微滴的尺寸。 当 PVA 含量进一步增加到 10% 时,分散相出现回流现象,无液晶微滴生成。

图 6 (A)液晶微滴生成尺寸与连续相粘度的关系; (B)不同 Qc/ Qd(a: 200 / 3; b: 200 / 8; c: 200 / 30)下液晶微滴尺寸与孔口宽度的关系

2. 4 孔口宽度对液晶微滴生成的影响

两相流体交汇处狭窄孔口形状决定了局部流场变化,从而影响微滴的形成。 固定连续相与分散相流速分别为200和3μL / h,当孔口尺寸从30μm 增加到60μm 时,液晶微滴尺寸从(56 ± 0.83) μm增加到(90±2.20) μm(图6B)。 当改变连续相和分散相流速比时,液晶微滴尺寸同样随着孔口尺寸增加而增加(图6B)。 当孔口尺寸足够宽时,连续相对分散相的压力难以累积,需要更长时间才能将分散相剪断。 因此,对于固定的两相流速,孔口尺寸宽的通道所形成微滴尺寸更大。

2. 5 DCA 检测研究

SDS 修饰的 5CB 微滴常用于肝肠疾病潜在标志物胆汁酸的传感检测。胆汁酸分子在 5CB 微滴表面吸附可以扰乱SDS排列,引起微滴内液晶分子取向变化。 通过偏光显微镜观察此变化引起的液晶微滴构型从“射线型”到“双极型”的转变,可以实现胆汁酸分子的检测。 选取3种不同尺寸的液晶微滴(77、70 和38μm)探究微滴尺寸对传感性能的影响。加入200μmol / L DCA后, 77μm的液晶微滴构型在1 min内完全从“放射型”构型变为“双极型”构型(图7A和7D),而38 μm的液晶微滴依然保持“放射型”构型(图7C和7F)。 70 μm液晶微滴中“放射型”构型中心缺陷出现了向微滴表面迁移的现象(图7B和7E),形成“放射型”到“双极型”的过渡态。将观测时间固定为 1 min,探究了3种液晶微滴(38、 70 和 77 μm)对 DCA 的检出限(定义为液晶微滴构型从“放射型”变为“双极型”的微滴数量百分比大于 30% 所 对 应 的 样 本 浓 度 )。3种液晶微滴的检出限分别为 ( 383 ± 23.6 ) μmol / L、(183 ± 23.6) μmol / L 和(140±14.1) μmol / L(图 7G),检出限随液晶微滴尺寸的增大而减小。 研究表明,液晶微滴尺寸通过影响决定微滴中液晶分子取向的 Saddle-splay(K24 )项表面弹性自由能,从而对微滴构型产生影响。 当微滴尺寸减小时,微滴倾向于呈现“放射型”构型,因而,较大尺寸液晶微滴更容易引起液晶微滴构型改变。

图 7 不同尺寸 PVA/ SDS-5CB 微滴在加入 200 μmol / L DCA 后 1 min 内的偏光显微图像(A ~ C)和相应的明场(D ~F)显微镜图像: (A、D)77 μm, (B、E)70 μm, (C、F)38 μm; (G)不同尺寸液晶微滴对DCA 的检出限。比例尺为100μm

结论

采用流动聚焦微结构系统研究了单分散液晶微滴的生成方法,并对不同尺寸液晶微滴的传感响应进行了初步研究分析。 通过调节连续相和分散相的流量、 粘度比以及微通道的孔口宽度,可以获得10 ~ 145μm稳定且尺寸均一的液晶微滴。 研究表明, 微通道中 两 相 流 量 均 较 小时为挤压流模式; 增大连续相流量,减小分散相流量后会变成滴流。 在滴流中,增大分散相流量,流型将从滴流变为射流。 进一步增加分散相流量,射流会变成管状流。 当连续相流量一定时,液晶微滴的尺寸随分散相流量增加而增大; 分散相流量固定时,随着连续相流量增大,液晶微滴尺寸减小。连续相粘度越大,分散相受到的粘性剪切力越大,液晶微滴尺寸越小。 微通道孔口尺寸越大,液晶微滴尺寸越大。比较流速比、连续相粘度以及孔口宽度3个因素对液晶微滴尺寸的影响发现,调节流速比,液晶微滴的尺寸差约可达90μm; 改变连续相粘度,液晶微滴的尺寸差约可达70μm; 而孔口宽度从30μm变为75μm时,液晶微滴的尺寸差约为50μm。利用3种尺寸(38、70和77μm)的单分散液晶微滴进行DCA检测时发现,越大的液晶微滴的检出限越低。 当液晶微滴尺寸从38μm增加到77μm时,液晶微滴对脱氧胆酸的检出限从(383±23.6 ) μmol / L降低到(140±14.1) μmol / L。

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