原创 微流控芯片液滴数字化分析用于快速定量检测细菌

摘 要 现有细菌定量检测多依赖专业实验室,检测周期较长。 针对此问题,本研究基于微流控芯片液滴数字化分析,建立了一种细菌定量检测方法。 采用具有平行液滴分析单元的微流控芯片,其特点在于使用了注射器真空驱动液滴产生方法。 借助刃天青显色反应引起的荧光强度改变,可指示液滴内活性细菌的存在。 通过计算细菌阳性液滴的比例,采用泊松分布算法,计算出原始样品中的细菌密度。 实验结果表明,本方法可在3. 5 h 内完成细菌定量分析,动态检测范围为 105~ 108 CFU/ mL,相对标准偏差(RSD)低于5% 。 本方法具有操作简便和分析速度快的优势,有望广泛用于细菌快速定量检测。

细菌定量检测对于食品安全、环境监测和疾病诊断均具有重要作用。 由于细菌定量检测经常在资源有限的情况下进行,而且对于检测时间要求很高,因此需要简便快速的检测方法。 目前,用于细菌定量检测的方法主要包括培养计数法、荧光定量分析 PCR、流式细胞术等,以及一些基于新型生物传感器的检测方法。 这些技术仍存在一定的局限性,如检测周期较长、操作步骤繁琐、依赖于大型设备和专业技术人员。 因此,迫切需要建立操作简便、分析快速的细菌定量检测方法。

液滴数字化分析是近年发展起来的一种高精度定量分析方法。 液滴数字化分析的原理是利用液滴技术将待测靶标随机分配到大量相互独立的微滴中,每个液滴中最多含有一个靶细胞,每个微滴相当于一个独立的微反应器; 继而针对待测靶标在微液滴中的直接或间接信号,区分阳性和阴性液滴。 阳性微滴判读为 1,阴性微滴判读为 0,可根据泊松分布原理进行计算,实现待测靶标的绝对定量分析。 与传统的分析技术相比,液滴数字化分析最突出的特点是其具有不依赖标准品的绝对定量分析能力。 此外,基于大规模液滴分散体系的数字化分析在检测灵敏度和定量分析精度等方面也显著优于传统定量分析方法。 鉴于微流控技术是大规模液滴操控的有利工具,微流控芯片成为数字化液滴分析的主要平台。

自液滴数字化分析提出以来,此技术被广泛用于多种类型的定量生物分析中, 包括核酸、蛋白和细胞分析,以及数字化细菌分析。 得益于微液滴对于反应信号的相对富集作用,以及数字化分析方法的高检测精度,数字化细菌分析在分析时间和定量分析精度等方面均显著优于传统的细菌定量分析。 Boedicker 等利用阿尔玛蓝指示细菌活性,结合液滴数字化分析技术,最快可在 2 h 内检测出样品中的活性细菌,并且能够在 7 h 内获得细菌的耐药性信息。 Kang 等结合 DNA 酶传感器与液滴数字化分析技术,能够在 3 h 内得到血液样品中的细菌定量分析信息,其实际密度与理论值的相关性良好(R2= 0. 999),测定下限达到 1 CFU/ mL。 Kaushik 等结合刃天青显色原理与液滴数字化分析技术,将细菌与显色体系限制在约 20 pL 的液滴中,能够在1 h内得到细菌的耐药性信息。Scheler等用含绿色荧光蛋白的大肠杆菌验证了液滴数字化分析的定量分析能力,与平板计数法结果的相关性良好(R2= 0. 9964),结合刃天青显色法原理,在 3 ~ 4 h 得到样品中细菌的耐药性信息。

液滴数字化分析不依赖标准品的绝对定量分析能力,以及在灵敏度和定量分析精度方面的优势,非常有利于现场快速细菌检测,然而,此技术在该领域的应用还鲜有报道。 其主要原因在于微流控芯片上的液滴发生多依赖基于气压或注射泵等流体驱动装置, 这类装置体积较大且操作繁琐,难以应用于现场快速检测。 相比较而言,正压驱动液滴发生方式使用广泛,文献已经报导了基于负压的液滴发生方法。 在负压驱动的液滴发生体系中,仅需要一个简单的注射器即可驱动油水两相液体流动,并发生液滴。 这种液滴发生方法操作简便,无需复杂结构流体控制设备,因而有望将液滴数字化细菌分析拓展到现场快速检测领域。

微流控芯片技术在生物样品分析中得到广泛的应用。 本研究基于负压驱动液滴微流控芯片,建立了一种细菌定量检测方法。 采用具有平行液滴分析单元的微流控芯片,其特点在于使用了注射器真空驱动的流动聚焦式液滴发生方法。 利用单个注射器,即可实现多个分析单元中的快速平行液滴发生和捕获。 以大肠杆菌为模式分析对象,借助刃天青显色反应,实现数字化液滴细菌定量分析。 依据显色反应阳性液滴的比例,使用泊松分布原理计算原始样品中的大肠杆菌密度。 实验结果表明,本方法具有操作简便和分析速度快的优势,有望用于细菌的现场快速定量检测。

微流控芯片

微流控芯片包含具有图形化结构的PDMS顶层和无结构的玻璃底层(图 1)。PDMS 层包含一组6个辐射状排列分析单元,汇聚于同一出口,即负压施加点。 每个单元包括上游的液滴发生器以及下游的液滴储存池。 PDMS层使用标准光刻-倒模工艺加工,等离子处理后,与玻璃底层封接。加工完成的芯片经紫外线照射 1 h,并于使用之前保存 1周。与芯片连接的特氟龙毛细管经高压消毒后保存备用。

图1 微流控芯片示意图

液滴数字化显色分析 液滴数字化显色分析流程如图 2 所示,具体操作如下1)使用特氟龙毛细管将注射器与芯片出口连接,将样品溶液和油相溶液分别加载到芯片的样品池和油相池; (2)拉动注射器针柄,利用注射器真空产生的负压驱动油相和水相溶液流动,引发液滴发生。

图 2 微流控芯片液滴数字化细菌分析流程示意图

注射器真空驱动的液滴发生

在注射器真空作用下,液滴分析单元的末端压力接近于 0,而入口端液面压力为 1 个大气压,这种压力差存在于每个分析单元。 因此,利用一个注射器可实现多个分析单元内的同步液滴发生。 在大气压驱动下,水相和油相共同进入芯片通道。 在十字型通道结构液滴发生器处,油相剪切力作用于水相,因而将水相切割为液滴。 液滴的尺寸由液滴发生器处通道尺寸以及油相和水相的流速决定。 对于本实验中,液滴发生器十字型通道的尺寸为:水相孔径20 滋m,油相孔径175μm,深度40μm。 在注射器真空驱动下,6个平行单元的液滴发生频率介于 180 ~ 193 Hz 之间,生成的液滴可在 3 min内充满液滴收集池。 成像分析(图3)显示,收集池内液滴变化范围介于 25. 69 ~ 33. 01μm 之间,每个单元内的液滴体积相对标准偏差(RSD)<2% ,均符合正态分布(p>0. 05)。 由此可见,这种注射器真空驱动发生的液滴均一性较好,满足数字化分析要求。 不同分析单元的液滴体积偏差的原因是单元内流动阻力的细微差异造成的流速差异。 由于液滴数字化分析引入了体积校正,不同单元内液滴体积的偏差并不影响定量分析结果。

液滴反应体系的稳定性

PDMS 材质芯片在长时间培养中存在水分迁移问题。 如图 4 所示,原生 PDMS 芯片中的液滴在连续培养中体积持续降低,3 h 内液滴体积可减少 95% 以上,提示存在水相-油相鄄PDMS 的水蒸汽迁移途径。本研究从两个方面采取措施,有效控制水分迁移问题:一是芯片底层采用密闭的玻璃材料,部分降低蒸发效应; 二是在PDMS顶层覆盖矿物油,降低蒸发。 如图 4 所示,在优化的芯片反应条件下,37℃ 孵育3 h 后,液滴体积只降低了13. 54%依 5. 65% ; 孵育 6 h 后,液滴体积也只降低了20. 79%依4. 68% 。

实验中还发现了油鄄水界面成分串扰问题。 在使用7500氟化油、十六烷和石蜡油的液滴体系中,均发现细菌穿梭于油鄄水界面(图 5)以及液滴内刃天青的油相扩散(图6),明显影响了液滴显色实验的稳定性和灵敏度。这些现象的产生可能是由于油-水界面的屏蔽作用不足。本研究通过调整表面活性剂浓度改善液滴稳定性。 结果表明,即使增加表面活性剂浓度,也不能完全消除7500氟化油、十六烷液滴体系存在的成分串扰,但添加3% ABIL EM90 的石蜡油则可完全杜绝此问题。这是因为外表面活性剂增强了油-水界面的稳定性,同时石蜡油具有较高的粘度,遏制了细菌游出。

图 3  6个单元内液滴的体积分布图

液滴内的细菌指示显色反应

液滴细菌显色反应以刃天为指示剂。 刃天青指示细菌活性的原理是:在活性细菌的多种还原酶作用下,无荧光的刃天青转变为有荧光的试卤灵。 鉴于液滴内细菌数量对于显色反应信号强度的影响,显色反应条件的优化均使用单细菌分散体系。本研究借助Syto 9染色,确定了适宜的输入细菌密度为1. 5*106 CFU/ mL。在此输入密度下,理论上,100%的液滴内细菌数≤1,即每个液滴最多包裹1个细菌。

图 4 优化的芯片反应条件抑制液滴内水分迁移

测定了刃天青显色信噪比相对孵育时间的变化,由图 7A 可见,培养 2 h 后,开始出现显著区别于噪声的荧光(+)信号。 根据图7A的结果分析培养5 h的阳性液滴数量稳定时间,如图7B所示,3. 5 h后,阳性液滴数不再增加,因此,后续实验均采用3. 5 h作为反应终点时间。 相较于传统试管方法12 h左右的显色反应时间,液滴显色反应所需时间大幅缩短,这得益于液滴分散对于样品和显色信号的相对富集效应。在液滴分散体系内只有部分液滴内包裹细菌,相应地液滴显色反应结果表现为“全冶或“无冶的形式,而宏观反应体系呈现的是平均反应强度。 对于包裹细菌的液滴,液滴内细菌密度较宏观体系提高。例如,直径30μm的液滴中包含单个细菌情况下,液滴内细菌密度约为 9*106 CFU/ mL,其密度相对于 106 CFU/ mL 密度的细菌悬液提升9倍,而相对于105 CFU/ mL 的细菌悬液提升了90倍。 由于液滴的封闭效应,液滴内的显色信号快速蓄积,因而可在较短时间内达到检测限。 由于不同种类细菌存在代谢活性差异,这种液滴数字化显色分析方法的普适性需要通过测试更多种类细菌进行验证。

图 5 不同油相条件下液滴的细菌屏蔽作用比较

为了验证液滴刃天青显色方法对于细菌的特异性指示效果,借助图像指示,在1个液滴细菌分散体系内随机抽取100个不含菌的液滴和100个含活性菌液滴,使用非参数秩和检验分析了两组液滴内荧光强度的差异。 结果表明,两组细菌的显色信号具有显著性差异( p<0. 05),提示液滴刃天青显色法可特异性指示活性细菌。

建立了一种基于微流控液滴数字化显色分析的细菌快速定量分析方法。 利用注射器真空发生液滴,操作简便可靠; 芯片采用平行分析单元设计,可提供适宜的测试通量。 本方法定量分析精度高,定量分析RSD低于5% ; 分析时间短,可在3. 5 h内获得细菌定量分析信息。 上述特点使得这种细菌定量分析方法非常适用于资源有限条件下的细菌快速检测。

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