原创 外加场分离技术与微流控技术联用在微纳尺度物质分离中的研究进展（下）

2.3 电场流动分离技术

场流分离技术最早由Giddings等发明,是分析分离领域用来分离大分子胶体和颗粒材料的一种分离方法,随着场流分离技术的不断发展,其也逐渐成为色谱分离体系中一项重要的分离技术。其中电场场流分离技术被越来越多的研究学者使用,其分离原理是通过在分离通道的上下壁(电极)所施加的直流电场或交流电场,对混合带电颗粒进行精准分离。该技术可以根据混合样品的大小与带电性质的不同进行分离和聚焦等处理,如图1c所示。传统的直流电场流分离技术是针对通道壁施加固定电压,通道壁表面在直流电场条件下形成双电层,降低通道内有效电场,导致电场场流分离技术的分离效率大大降低。在交流电场流分离技术中,施加的交流电场根据频率调节电场方向,减缓内电极表面形成的双电层,提高通道内有效电场,起到提高分离效率的作用。目前电场场流分离技术可以对颗粒物、生物细胞和外泌体等进行有效分离,被广泛应用于微纳米颗粒和细胞分离等领域。Tasci等为了改善纳米颗粒在交流电场场流分离中存在的小尺寸微纳尺度物质的扩散现象,对电参数中的偏置电压进行调节。该团队使用高于50%的偏置电压对50 nm以下颗粒物进行有效分离,结果证明通过调节偏置电压可以减小扩散现象对分离纳米颗粒的影响,提高分离效率。Petersen等利用交流电场场流分离技术对外泌体的分离进行研究,以交流电压为常量,流动相为变量的条件下对外泌体进行了分离,证实交流电场流分离技术可以对外泌体进行有效分离。

在电场场流分离技术中,电极容易产生电极极化的现象,限制了电场场流分离技术在微流控芯片中的应用。对此,本课题组提出了微颗粒分离“靶式分布”新概念毛细管靶式电场流分离技术,如图4所示。利用离子液体及介孔硅材料界面修饰技术解决了电极极化的问题,实现了在环形通道中对微纳尺度物质的在线分离。通过微流控芯片模拟该体系下颗粒物的运动情况,成功分离不同尺寸的聚苯乙烯颗粒物。该技术解决了传统电场流分离领域中电极极化的问题,并提出了颗粒物的靶式分布和锥形排列新理念,在单细胞分离分析、外泌体分离等具有广阔的应用前景。

图4   开管式毛细管电场流微分离技术原理示意图

2.4 电渗分离

感应电荷电渗是导体表面与电场相互作用产生的双电层的扩散层在切向电场作用下产生微旋涡的一种电化学效应。在电场条件下电极表面发生极化现象形成双电层,双电层分为致密层与扩散层,其中扩散层在电场作用下发生移动,致密层中离子不动,进而在电场内形成涡旋,混合样品中不同带电特性的样品将会随着涡旋逐渐向悬浮电极中心移动,根据不同的运动行为,达到分离作用,如图1d所示。基于ICEO的颗粒分离方法具有可调节流型、操作方便、无接触等优点。

Chen等提出了一种利用诱导电荷电渗透在连续流体中分离颗粒的微流控芯片装置,如图5所示。利用ICEO产生涡旋成功对聚苯乙烯颗粒与二氧化硅微粒颗粒物进行分离,分离效率在99%以上。ICEO对酵母细胞的纯化回收率超过96%。感应电荷电渗透技术在与微流控技术联用后,可以针对不同样品进行聚焦、分离和纯化等实验,为今后生物、医疗和化学领域的微纳尺度物质分离提供一种有效技术支撑。

图5   基于诱导电荷电渗透的微流控分离系统

综上描述,电场分离技术的无标记分离、高选择性以及高效分离等特点和微流控装置样品量少、金属污染少、样品制备简单等特性的结合大大提高了对生物细胞和微纳米颗粒的精准分离、捕获及聚焦等效果。在微纳尺度物质分离领域中具有良好的应用前景。

3 基于外加磁场的分离技术

近年来,利用外加磁场的作用操纵微颗粒、细胞等微纳米尺度物质分离分析逐渐被重视起来。磁场分离技术中磁性纳米颗粒与目标物可以简单有效的结合,磁场条件下可以对包裹磁性纳米颗粒的样品实现温和、无损和高通量的快速分离,因此在分离微纳尺度物质研究中成为最佳选择之一。同时,在微流控体系下采用磁珠分离方法对微纳尺度物质进行分离也已非常普遍。越来越多的研究学者将磁场分离技术与微流控技术进行联用,在微流控体系下的磁场分离技术利用磁性颗粒修饰的抗体或官能团,与所需的细胞或蛋白质进行特异性结合,在不同磁场条件下微流控连续分离装置可以分离不同类型的微尺度混合物,利用磁场与微流控技术的耦合装置可以分离磁性颗粒与非磁性颗粒,以及带有不同性质的磁性颗粒物。所以利用磁场分离技术与微流控装置结构进行联用受到国内外研究者的广泛关注。Kumar等开发了一种新型的微流控装置,该装置采用永磁体,在0.5~5 mL/h流速范围内研究了11个聚氰胺微粒子对薄微通道壁的无鞘液磁性聚焦。将顺磁性粒子的混合物注入该装置以演示其分选原理。两种不同尺寸的混合磁粒子均沿通道壁排列,在设备前半段达到聚焦,不同尺寸大小目标物位于不同的流线上,在进入膨胀区域时,被分割成明显的流线以达到分离的效果。通过磁场场流分离与微流控装置的联用,达到了高通量(10000 cells/s)和高纯度(98%)的效果。该方法克服了传统磁泳法操作复杂、准备和操作时间长等局限性,将磁场分离技术与微流控技术进行联用,从而对不同尺寸、不同磁性的微纳米颗粒和生物细胞进行分离分析。

Pamme等利用特定的微流控装置对磁性纳米颗粒和非磁性纳米颗粒进行连续流动分离,如图6a所示。通过将混合样品注入装置内的分离室,颗粒物在受到垂直向上的磁力作用下,根据颗粒物自身磁化率和大小等性质不同,在不同的层流方向上产生偏转达到分离的效果。利用微流控分离通道设计性强的优点,可以根据混合样品的磁性不同来调节磁铁的具体位置,达到精确分离的效果,分离后的目标物在微流控装置的不同出口处流出,进入到不同的缓冲层,在下游对其进行多步生化处理,为后续实验做准备。

图6   基于磁场的微流控分离系统

Malica等以食源性病原体引起的人体感染疾病问题作为出发点,针对单核细胞增生李斯特菌引起的感染对卫生安全构成威胁等问题进行研究,提出了利用磁性纳米粒子对其进行免疫磁分离。根据它可以有效对目标细胞进行捕获的优点,与微流控技术耦合制作了一个磁场-微流控芯片装置,如图6b所示,该装置的磁捕获区由多个涂覆了软铁磁镍的圆柱组成,可以产生强大可切换的三维磁陷阱,并利用数值和相关理论分析预测磁陷阱周围的磁场分布,对磁标记的细菌进行高效磁捕获和释放,具有灵活、可定制、低成本等特点,还可以针对各种微米以及亚微米级别目标物分离捕获,对MNPs的最大回收率为91%,活菌的最大捕获效率为30%。该微流控装置可以对食品安全细菌检测提供技术支持。

Moser等提出了一种在芯片上捕获蛋白质的磁珠免疫凝集方法,如图6c所示,该方法利用垂直在流动方向上的磁力,使磁性颗粒固定凝集在通道壁上,而磁场梯度的周期性翻转和力场的变化使磁珠在通道内不停地做循环运动,形成更大的磁粒子动态塞,用来捕获流动相中的目标物,并用简单的光学检测方法确定免疫凝集的磁珠量以及浓度,为芯片上蛋白质捕获领域提供了一个更加有效的技术支持。

Ungerbock等对磁光传感器粒子在微流控装置中的实用性进行了评价,如图6d所示。MOSePs可以用于任何带有光学透明微流控芯片的微观氧气成像、多重分析物的并行监测和作为灵活的传感器点监测酶活性,当无法集成传感器层时,也可以在微流控结构中形成固定传感器点。以氧传感器为例,Ungerbock等研究了不同直径的MOSePs的积累特性以及在不同流速下原位传感器的稳定性,利用马高列斯荧光黄色染料(MFY)和路玛近红色染料(LR)对磁光传感粒子进行染色,再从外部使用磁铁装置对其进行分离。实验结果证明,MoSePs作为微流控器件中的一部分,促进发光传感器领域的进一步集成。

综上所述,磁场的无标记特性与微流控技术的联用,在微流控芯片装置内部将微纳尺度物质根据自身性质(大小、磁化率)的不同,实现对微纳米颗粒的在线连续分离,达到对目标样品的快速、无损和高效分离和捕获。

4 基于外加声场的分离技术

在微纳米尺度下如何实现微颗粒的精准操纵一直是研究的热门。研究发现,施加外场的方式可以实现对微颗粒的操纵,其中运用声场的方式相较于其他外场来说所需能量更小,不会损坏细胞等微纳尺度物质活性和对样品电性和磁性等无特殊要求,因此适用面更为广泛。声场分离技术是指在微流体系统中利用声辐射力操纵悬浮液中的微纳尺度物质分离的一种技术。ARF的表现形式可以分为体声波或表面声波。SAW更容易通过增加频率来调节粒子运动速度,从而操纵粒子的运动,甚至可以驱动流动相。另外,在1988年,Semyonov等首次提出声场场流分离技术。它可以将液体内部的胶体颗粒、蛋白质和细胞等物质进行聚焦分离处理,利用声辐射力作为驱动流动相中混合颗粒物的外力,根据混合样品中各个微粒的大小、尺寸和密度等性质所产生的运动行为在微流控芯片装置中起到分离作用,以及利用小尺寸颗粒物在流动相中的扩散起到抑制的作用,达到精准分离和聚焦的效果,目前广泛应用于细胞筛选、细胞捕获和生物聚合物分离等。体声波微流控芯片可以利用驻波的声泳力来提高吞吐量,也可以对颗粒物进行聚焦。这两种方法具有细胞损害小、保持细胞完整性和装置便捷的优点。Hwang等研制了一种声场场流分离装置,在特定的微流控装置的通道中,沿重力方向上释放超声波驻波并在通道底部形成一个压力节点。同一方向的声场力和重力对小尺寸混合颗粒物起到抑制扩散的作用。通过荧光显微镜的检测观察,该微流控装置成功对1.0、3.5和10 μm的混合荧光颗粒物进行了有效分离。

Jakobsson等提出了一种利用超声波驻波在微流控通道内部对红细胞进行聚焦和控制的方法,如图7a所示。红细胞可以用来检测生物细胞的生理状态,但是细胞在流动相中面向激光光源的横截面位置不同,因此相同细胞所处不同的横截面时可能检测出不同的光散射测量值,所以控制红细胞的定向能力对生物医疗分离是有必要的。该团队利用声波对细胞无损害、灵敏性强的特点在微流控芯片中利用驻波声场将红细胞的横截面最小的尺寸方向与声场方向平行。结果表明,有87.8%±3.8%的红细胞可以水平定向,有98.7%±0.3%的红细胞可以垂直定向。该技术对快速发展的流式细胞计数和图像细胞计数都有潜在贡献。

图7   基于声场的微流控分离系统

Li等发现从癌症患者的临床样品中筛选循环肿瘤细胞存在技术限制、吞吐量不足和缺乏设备长期稳定性等问题,选择利用声场力无标签和无接触分选的优点并结合微流控装置高吞吐量的优势制作了一种倾斜角站立表面声波微流控装置,如图7b所示。该装置可以在流速为20 μL/min的条件下将循环肿瘤细胞从白细胞中进行有效分离,并且针对癌细胞的回收率可以达到83%~96%,白细胞的去除率达到99%。这种方法适用于分离和白细胞有显著大小和密度差异的癌细胞,利用倾斜角度的驻表面声波装置对临床样本进行高通量分离,从白细胞中分离罕见癌细胞的效率比以往技术具有更高的分离性能,并适用于细胞清洗、细胞同步、血液成分分离和细菌分离等。

Ahmed等制作了一种倾斜角度的表面声波的无鞘液聚焦和连续流中的粒子分离装置,如图7c所示,利用两个互相交叉传感器产生与流动方向呈30°的高频倾斜角度表面声波,在不使用鞘液的条件下直接对粒子施加声辐力,分别在194 MHz和136 MHz频率下通过IDTs的激发,粒子被连续聚焦在微通道壁面的一侧,在流速为83.3 mm/s下,taTSAW微流控装置对4.8 μm和3.2 μm颗粒的样品混合物聚焦并分离,分离纯度高达99%。在两个微流控通道出口处颗粒分离率分别为93%和100%。这种方法较其他分离技术相比,不需要额外的鞘层流来进行聚焦处理,在生物和生物医学领域具有潜在的应用价值。

声场也可以对目标物进行聚焦处理,例如Liu等利用简单低成本的环形压电传感器制作了一种有压电环阵列组成的声流控多孔板微流控装置,用于在每个板中心快速富集微纳尺度物质,如图7d所示,在玻璃基板上的圆形驻波产生向内的径向声流,诱使微纳尺度物质在声场力的带动下将每个孔中的微纳尺度物质进行富集。实验结果证实,在0.4~30 μm范围内均可进行操纵且具有良好富集效果。具有低成本、低功耗、简单和可控性强等优点,可以在生物和医疗等领域成为强大的工具。

Shi等利用驻波表面声波聚焦技术在软光刻法制备的聚二甲基硅氧烷通道上进行聚焦实验。如图7e所示,样品在压力驱动力作用下注入微流控通道内,受到两组在悬浮液中相同且延相反方向传播的表面声波形成驻声表面波(SSAWs),通过调节两个IDT释放的波长控制SSAWs的压力节点和反压力节点位置,进而控制其在流体中的周期性压力节点(最小压力)和反正压力节点(最大压力),当通道仅覆盖一个压力节点时,样品受声场影响在中心线处聚焦,由于不同尺寸颗粒物在通道内的运动距离不同,较大尺寸颗粒物比较小尺寸颗粒物有更大的横向位移,该装置对0.87 μm和4.17 μm的乳胶粒子在360 ms内进行了分离。该方法具有操作简单、快速便捷等优势,几乎可用于任何微粒的聚焦。

综上所述,声泳分离技术作为与生物样品非接触的分离方式,在分离生物细胞时具有不破坏生物样品性的优势。将声泳分离技术与微流控技术进行联用可以弥补传统声泳技术装置庞大、操作复杂和对尺寸差异较小的颗粒分辨率低等缺点,从而达到高通量、无损害和操作简单的分离效果,为单细胞分离和捕获等领域提供重要的技术支持。

5 总结与展望

利用流动场、电场、磁场和声场等主动场分离技术与微流控技术的联用,可以提高在不同条件下对微纳尺度物质的分离与富集能力。本文综述了4种外加场在微流控技术中的研究进展以及在未来的发展趋势,流场场流分离技术利用温和分离的特性,成功对蛋白质和DNA等物质进行分离,并与其他检测器耦合,对不同样品表征精细化和对生物细胞的分离具有重要意义。在基于电场分离的微流控技术中因物质本身或外部环境影响使其具有带电特性,所以基于电场的微流控技术应用比较广泛,且可实现对微纳尺度物质的无标签、高选择性和高效分离;基于磁场的微流控技术对物质本身磁性要求更为严格,且部分需要对目标物进行标记,难以实现无损分离,因此对分离分析较为脆弱的生物细胞存在限制;将声场和微流控技术联用的装置可以利用声场力对细胞进行精准操控,实现目标物无损伤、高通量、快速的分离。利用主动场分离技术选择性好、分离度高等优点,结合微流控技术的具有微型化、集成化、成本低廉等优势,达到使复杂分析方案合理化,显著减少样品体积和试剂成本,在处理微量样品时具有快速化学分析、高吞吐量和高分辨率的效果,对生物样品的富集浓缩都有较大的研究前景和价值。从应用方面来看,利用微流控芯片实现微纳尺度物质的分离是社会发展的必然趋势,但由于外加场装置普遍都需要复杂庞大的驱动装置,所以实现整个系统的微型化、便捷化仍是迫切的应用需求。随着相关技术的不断发展和进步,未来将会真正实现微型化、集成化的微流控主动场分离技术应用于癌细胞的筛选、癌症的早期检测、微尺度物质的精准分离等各个方面。

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