原创基于微流控的血细胞和干细胞流变学行为研究进展

 2024-3-11 13:25  405 5 5 分类: 医疗电子

微流控芯片作为一种微全分析技术平台，具有精确流量控制、少量样本需求和可集成化等诸多优势，已被广泛应用于生物医学和环境科学等领域。利用微流控通道结构设计灵活的特点，可在实验条件下模拟生理和病理条件下的复杂血管微环境，其与超分辨显微成像技术的整合使得研究人员能够实时观察和分析微观尺度下的细胞动态变化过程。因此，用微流控芯片系统研究细胞形态和力学特性方面也取得了重要进展。本文重点介绍了微流控芯片技术及基于微流控的数值仿真模拟手段在红细胞、白细胞及干细胞变形和流变学行为中的应用及进展。首先，我们介绍了微流控芯片技术及相关数值仿真手段在红细胞流动变形研究中的应用；接着，我们总结了微流控芯片系统及相关数值模拟在白细胞边集及迁移行为的研究进展；此外，我们也概括了微流控芯片系统及相关数值模拟在干细胞迁移和定向分化机制方面的研究进展。最后，我们总结并展望了微流控芯片技术及其相关的数值模拟在血细胞及干细胞流变学研究中的挑战和未来发展趋势。

引言

微流控芯片（Microfluidics）是一种集成了微流体技术和芯片制造技术的新型实验平台，用于控制微量液体和颗粒在微小尺度下的运动和反应。该技术通过微型化和集成化设计，实现了对微量液体及颗粒的高精度操控和实时监测，具有高通量、快速分析和低成本等优点，目前已广泛应用于生物医学和环境科学等研究领域。特别地，由于微流控芯片具有设计灵活的优势，可通过各类通道及电子元器件的排列组合来模拟人体组织内的脉管系统，为细胞培养提供稳定的微环境。因此利用微流控芯片技术已经成为血细胞和干细胞变形和流动性研究的重要工具。此外，数值仿真技术与微流控芯片技术的结合可进一步帮助人们深入研究细胞行为。依托细胞几何形态和力学特性，在细胞整体水平建立细胞数值仿真模型，可用于模拟研究细胞流变学行为、分析预测多种外部及内部因素对细胞流变学特性的影响规律，并对微流控芯片结构的优化设计提供一定的理论指导。

红细胞（Red blood cell，RBC），又称红血球，呈双凹盘状，直径约为 7-8 微米。红细胞膜为薄的脂质双层膜，内部充满血红蛋白溶液，属于高度可变形的充液弹性薄壳体。红细胞是血液中数量最多的一种血细胞（约占血液压积的 45%），能随血液流动遍及全身，负责运输氧气和二氧化碳，维护组织器官的正常功能。在血液循环过程中，红细胞会穿过各种尺寸的血管，大到 4 毫米到小到 5 微米，承受着重力、拉力和剪切力。然而，在病理条件下，红细胞的变形能力降低，血液的高切应力增加，会导致外周阻力增大，影响血液循环以及组织和器官的血液供应。因此，研究红细胞在生理和病理条件下的变形性能对于理解血液循环及相关血液疾病的临床表现具有重要意义。微流控通道可在实验条件下模拟生理和病理条件下的复杂血管微环境，可用于探索红细胞在毛细血管或多级血管分支网络中的流动行为和变形性能，模拟体内微血管堵塞及血栓形成过程。在此基础上，为了进一步量化分析红细胞在微通道内的流变学行为，我们也对基于微流控芯片系统建立的相关数值仿真模型模拟研究进行了分析总结。

白细胞是一种无色有核的血细胞，体积比红细胞大，一般情况下形状接近球形,大小约为10-12 微米。白细胞具有活跃的活动能力，能够从血管内迁移到血管外，或从外周组织迁移到血液循环中。因此，除了存在于血液和淋巴中，白细胞也广泛分布于血管和淋巴管以外的组织中，在人体免疫系统中发挥着重要作用，包括对损伤或感染的炎症区域作出反应。白细胞从血液到靶组织的外渗和迁移是炎症反应的重要步骤。这个多步骤过程受到血流动力学和各种生化信号的严格调控。因此,白细胞外渗过多、时间过长或定向错误是动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病和多发性硬化等多种炎症性疾病的发病机制之一。因此，借助微流控技术并结合数值仿真模拟研究白细胞迁移动力学过程具有非常重要的意义。

再生医学和基于干细胞（Stem cell，SC）的细胞治疗已成为当今世界各国先进生物医疗技术关注的焦点。其主要细胞来源是具有自我更新和多向分化潜能优点的干细胞。以被认为最接近临床应用的干细胞产品——间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）为例，许多临床试验已经研究了间充质干细胞在治疗炎症损伤组织、脑和脊髓损伤等疾病中的疗效。干细胞疗法产生疗效的基础是干细胞的归巢行为（Homing），即在趋化因子的作用下从循环系统迁移到靶向部位的过程。随后干细胞将进行定向分化，从而起到组织再生的治疗作用。因此，基于干细胞的治疗面临的主要挑战之一是如何提高细胞的归巢效率。归巢行为分为被动归巢（堵塞在微血管中跨内皮迁移）和主动归巢（主动贴壁后跨内皮迁移），它们不仅受遗传和化学因素的影响，其力学表型也至关重要。细胞的硬度、膜张力和变形能力等力学特性会直接影响细胞在血管中的变形、流动和组织中的迁移等过程。传统的细胞研究方法无法为异质性较高的干细胞提供足够精准高效的力学表型数据，而微流控技术不仅成本低、通量高，还可模拟并调控干细胞生长、迁移分化所需的小生境（Niche）。因此，微流控芯片系统为观察和调节干细胞的力学特性，并系统研究细胞归巢、迁移和分化等功能提供了有力的工具。

随着计算机技术的发展，数值仿真模拟技术也日渐成为血细胞和干细胞流变学行为研究中的重要工具之一。基于微流控芯片系统的数值仿真技术的可用于微流道结构优化设计、实验参数敏感性分析等。基于弹性理论和流体力学的连续体力模型和基于粒子模拟方法的离散网格模型是目前研究血细胞流动和变形行为的两大主流模型。连续体力模型（如浸入式边界法和边界积分法）是基于欧拉网格求解方法建立的，通常将细胞膜和细胞液视为均质材料，容易实现与现有的计算流体力学求解器耦合，常用于模拟含有大量血细胞的血液流动及细胞交互作用。基于粒子的离散网格模型（如多粒子碰撞动力学方法、光滑耗散粒子动力学方法和光滑粒子动力学方法）是将细胞膜、细胞液和血浆视为粗粒化粒子，其优势主要体现在处理细胞膜复杂微结构问题上，如病理状态下细胞膜与细胞骨架的分离现象、细胞膜的热涨落等。需要注意的是，此方法在进行流体运动的模拟计算时，并非严格遵循纳维-斯托克斯方程，导致该方法的计算精度较低。

本文综述了近年来微流控芯片系统及基于微流控芯片的数值仿真模型模拟在血细胞和干细胞流变学行为中的研究进展（如图1）。本文首先介绍了微流控芯片技术及基于微流控系统的数值仿真技术在红细胞变形研究中的应用；接着介绍了微流控芯片系统及相关数值模拟模型在白细胞边集和迁移行为研究中的应用。在干细胞归巢研究中，微流控芯片系统可以通过设计特定的微流道结构和生物信号化学梯度，模拟干细胞在体内归巢的过程，研究干细胞迁移和定向分化的机制，并为干细胞治疗提供指导。鉴于干细胞归巢的数值模型仿真工作较少，只对其进行了简要介绍。

图1 不同结构设计的微流控芯片系统在细胞力学研究领域的应用概述

1 微流控芯片系统及数值模型模拟在红细胞流动变形行为研究进展

1.1 基于微流控芯片系统的红细胞变形特性研究

用于红细胞变形性研究的微流控芯片可根据芯片复杂程度分为两大类：单通道芯片和多通道芯片。他们可以分别用于模拟红细胞在直通毛细血管和复杂血管分支网络中的流动行为。单通道微流控芯片具有高灵敏度，可以直接观察到细胞和亚细胞水平的动态过程。Quinn 等人通过单通道微流控芯片定量探究了健康红细胞在毛细血管内的流变规律。他们通过调节通道出入口的压力差控制流体流速，以模拟真实毛细血管中的流动工况。在压力驱动下，红细胞可以穿过横截面积只有 8 平方微米左右的狭窄通道，发现细胞流动速度与压力差存在线性关系。鉴于红细胞流变学功能障碍的一个常见指标是红细胞可变形性的降低，探究红细胞的变形能力对于理解相关血液疾病具有重要意义。基于此，Guo 等人在此芯片基础上进行了改进，设计了多个串行的漏斗形渐缩毛细通道来探究健康红细胞的挤压变形规律。他们发现了一个具有高度可重复性的物理量——皮质张力来表征红细胞的变形性能。类似地，皮质张力可用于衡量病理条件下红细胞的变形性能，辅助相关血液疾病（如遗传性球形红细胞症、镰状红细胞贫血症等）的临床诊断，从而获得有关血液疾病临床状态以及药物治疗的一些关键信息。Guo 等人将这样的微流控芯片用于研究疟疾感染红细胞的变形性能的变化，并根据测定的红细胞过毛细通道的驱动压力值来判断恶性疟原虫感染红细胞的严重程度。

由于单通道微流控芯片的通量有限，无法并行研究多个细胞的力学表型，人们设计出了多通道微流控芯片来弥补单通道芯片的通量缺陷，以满足疟疾患者血样中的低浓度疟疾感染红细胞的收集和分析。此外，多通道微流控芯片的多维网格可以模拟复杂的分支血管形态，构建更逼真的血流微循环环境。Bow 等人设计了一种多通道并行排列的微管道阵列，利用宽度仅为 3 微米的通道构建受限空间。在这样的微流控芯片中，健康的红细胞会快速通过微通道，而疟疾感染红细胞因其较差的变形性而难以挤入狭窄微通道。镰状红细胞贫血症是一种常见的遗传性血液疾病，临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以及局部缺血，导致组织器官损害。由于镰变红细胞对微环境中的氧气浓度十分敏感，想要模拟红细胞在毛细血管中的流动及堵塞需要实验装置能实现对氧气浓度的调控，这对常规实验装置来说是个极大的挑战。Du 等人利用互联多通道微流控装置解决了这一难题，并实现了氧气浓度可调的仿生毛细血管微环境。通过调节氧气浓度，可以控制红细胞的镰变过程并分析红细胞从发生镰变到导致镰状细胞危象的整个过程。镰变红细胞不仅影响自身变形能力造成毛细血管及小静脉堵塞，还会增加血液粘滞性，从而导致一系列炎症反应并在相应部位产生疼痛危象。Papageorgiou 等人通过微流控实验发现镰变初期的红细胞在毛细管中显著地粘附于管道内壁，低氧浓度会进一步增强镰变红细胞的粘附，但氧气浓度的改变对镰变末期的红细胞的粘附能力无明显影响。

1.2 基于微流控芯片系统的红细胞疲劳特性研究

红细胞随血流在体内流动时，当流经毛细血管时会发生挤压变形，其形态从双凹圆盘形逐渐转变为球形，变形性下降，进而造成毛细血管的堵塞。另外，在血液储存过程中，红细胞的形态、结构和功能也会发生变化，这些变化被称为储存损伤。近年来，一些学者采用微流控实验方法从形态学、生物力学等角度对红细胞储存损伤展开研究，例如，Zheng 等基于双流体聚焦原理，采用微流控实验方法研究了红细胞在储存周期内变形性的改变。研究发现，随着储存时间增加，球形红细胞数目增多，红细胞的分布宽度也会明显变宽。但红细胞的松弛时间恢复系数却显著降低，证实是由于红细胞内 ATP 的消耗引发细胞骨架重组，导致细胞膜硬化和更快的恢复速率。这些结果表明可以使用时间恢复系数和细胞分布宽度来衡量储存的红细胞质量。

红细胞疲劳是指在机械拉伸力的循环加载下，其形态和力学特性呈现显著变化的现象。然而，红细胞在体内循环时受到挤压变形而导致的疲劳损伤程度很难在体内直接测量，这给研究疲劳过程中红细胞的变形特性和生物力学特性带来了巨大挑战。近年来，研究人员借助微流控平台尝试在体外模拟这一过程，以研究红细胞疲劳的潜在影响机制。例如，Sakuma 等人采用微流控实验方法（如图 2），提出了一种衡量红细胞疲劳状态的指标。他们通过注射器对微通道中的红细胞传递往复的机械应力，精准控制红细胞数百次的循环挤压变形。研究发现，随着循环挤压次数的增加，红细胞逐渐失去变形能力：微通道出口处的细胞长度与细胞离开通道后的长度相等，并且不同细胞样本具有相同的疲劳趋势和不同的临界数值。这些结果证实了采用细胞失去变形能力的临界挤压数值来评价疲劳状态的可行性。进一步研究发现该临界数值与变形指数呈线性关系，因此变形指数也可作为细胞疲劳状态的评价指标。Qiang 等人采用调幅电变形和微流控芯片系统来表征单个红细胞的动态疲劳程度。该方法不仅可以对通道内的红细胞施加静态载荷，也可以通过在微流控装置的交叉电极两端加载正弦波信号，实现红细胞的循环拉伸变形。研究发现随着拉伸次数增加，红细胞逐渐丧失可恢复性，且峰值载荷越大，细胞变形能力下降更加显著。该结果证实了在循环载荷作用下，红细胞也会产生机械疲劳效应，且在相同的累积加载时间和相同的最大载荷下，循环载荷对红细胞造成的膜损伤明显大于持续的静态载荷情况。此外，Pan 等人设计了类似 ECMO 结构的多通道微流控芯片，研究了红细胞在周期性挤压下的疲劳响应机制。他们发现，当红细胞经历周期性挤压变形后，细胞内 ATP 水平降低，其形态逐渐棘形化，导致变形能力下降；然而，在低挤压频率下，细胞不容易出现机械疲劳现象。这些结果揭示了以挤压频率为主导的疲劳机制，并表明细胞疲劳程度与细胞内 ATP 水平的关联性。由此可见，机械疲劳在影响细胞力学特性方面有着重要作用。

图2 采用微流控芯片技术评估红细胞的疲劳损伤程度

红细胞在其生命周期内会不断经历循环挤压变形，直至被脾脏清除。为了更好地了解脾脏清除衰老红细胞的潜在力学机制，Antoni 等人设计了一种含有狭窄微通道的微流控芯片，用来研究红细胞在循环应力作用下反复穿越脾狭缝的流动变形特性。他们通过量化红细胞挤压次数与细胞体积、球度指数、弯曲模量等参数的变化关系，并结合细胞骨架-膜蛋白成分分析，认为囊泡的释放、细胞球形化及膜蛋白损失是导致衰老红细胞更易被巨噬细胞吞噬清除的主要原因。此外，在血液循环中，红细胞会反复流经富阳和缺氧的器官组织，氧张力水平的反复变化会影响血红蛋白的氧亲和力，从而改变细胞的变形性能。例如，在镰状红细胞贫血病中，研究表明氧气转运机制障碍会导致红细胞变形能力下降。为此，Qiang 等人采用微流控芯片系统分析了缺氧环境对红细胞疲劳特性的影响。基于不同低氧浓度环境的实验结果，他们分析了健康红细胞和镰状红细胞经历不同拉伸时间后的变形性能变化，发现镰状红细胞会更快进入疲劳状态。

1.3 红细胞在微管道中流动变形的数值模型模拟

人们通过设计不同的微流控芯片系统对红细胞的流动变形特性进行了大量的实验研究。然而，关于单个红细胞在最小毛细管相关长度尺度（约3 微米）中的流动特性仅有定性结果，缺乏充足的定量分析来更好地理解红细胞的流动变形规律及影响机制。此外，微流控通道只能观测到红细胞的二维变化，第三个维度上的数据无法通过实验直接获取。因此，学者们基于微流控实验结果建立了红细胞的数值模型，模拟生理/病理红细胞在穿越脾脏内皮间狭缝、毛细血管、复杂血管分支网络等多个尺度管道时的不同流变学特性（见图 3（1））。

脾脏在人体中起着储存血液、造血、清除老化红细胞和进行免疫应答的角色，其清除老化血细胞的力学机制就是利用狭窄的内皮间狭缝过滤变形性能较差的病变或衰老红细胞。Pivkin 等人通过数值模拟发现红细胞的体面比比其膜刚度更能决定红细胞在脾狭缝中的截留率。Ma 及其合作者利用类似的数值模型发现在红细胞达到被困在脾狭缝中的临界体面比之前，红细胞直径的减小可以缩短其通过脾狭缝所需的时间，而膜粘度的增加则会减慢其通过速度（如图 3(2)）。此外，老化相关的膜面积损失过程中，需要更大的临界压力梯度才能使红细胞变形以通过脾狭缝，从而导致更强烈的损伤，使得其在下一轮脾狭缝“考验”中的截留概率升高。Quinn 等人在单通道微流控实验基础上进行了基于耗散粒子动力学方法的数值模拟（如图 3（3）），表征了红细胞在穿越宽度分别为 3 微米及 6 微米的毛细通道时的局部膜面积膨胀率，发现红细胞的头部面积膨胀最多，表明在变形时红细胞头部受到的应力最大。为了深入了解在多级血管中红细胞的流动特性，Li 等人发展了一个具有流入/流出边界条件的模型模拟方法，用于模拟研究红细胞悬浮液在分叉微血管网络中的流动变形行为。他们的结果表明，流体在微血管主分叉管道内的速度幅度较大，而在小分支内的速度幅度相对均匀，速度分布呈典型的塞状（如图 3（4））。Wang 等人使用浸入式边界方法对红细胞在不同直径微通道内流动、变形和传质进行了数值分析，从细胞尺度阐明了微循环系统中细胞膜的力学特性与流场剪切特性和微管对细胞的几何约束等多种因素之间相互耦合作用下的传质特性。Ai 等人利用浸没有限元方法研究了零质量射流作用下红细胞在微通道中的运动变形过程, 分析了压力梯度和射流振动频率、振幅等参数对细胞膜力敏通道开启程度的影响规律。Xiao 等人借助耗散粒子动力学模拟方法研究了红细胞在渐缩-渐扩通道内的流动变形行为，分析了颈缩口尺寸等因素对红细胞通过渐缩-渐扩通道的影响规律。Ye 等人利用耗散粒子动力学及光滑粒子流体动力学模拟方法研究了红细胞在复杂管内及流体芯片中的运动、变形以及聚集行为。这些模拟研究可帮助人们在细胞-亚细胞等层面理解健康和血液疾病中的红细胞在毛细血管内的流动规律及机制。