原创 ​​微流控芯片系统及数值模型模拟在白细胞流变学行为研究进展

​​微流控芯片系统及数值模型模拟在白细胞流变学行为研究进展

2.1 基于微流控芯片系统的白细胞流动变形特性研究

白细胞在随血液流动过程中，收到惯性升力和细胞-血管壁相互作用的影响，会发生边集并贴附在血管内壁进行滚动。白细胞的滚动行为受两种力的支配，即血流的剪切应力和白细胞膜-血管内皮间的粘附作用力。炎症的最初迹象之一是白细胞粘附在静脉血管壁上。这种粘附始于粒细胞沿静脉血管壁的滚动运动，其速度远远慢于红细胞在相同血管中的流动速度。在滚动与粘附的过程中，白细胞能够识别趋化因子并接收炎症信号。随着炎症的发展,越来越多的滚动白细胞停滞下来，其中一部分白细胞外渗出血管至炎症区域所在的部位。

在输血前，需要对提供的血液进行白细胞滤过，因为白细胞在输注到患者身上时会被其自身的白细胞抵御，引发各种不良反应。白细胞在血液中边集的这一动态特性可以用于白细胞的滤过。Xia 等人就利用受控增量过滤（Controlled incremental filtration，CIF）技术设计了一种微流控芯片系统，可以高效过滤分离白细胞。在该装置中，有一个主通道和位于两侧平行的侧通道，利用主通道与侧通道之间规则分布的间隙过滤分离白细胞。他们经实验证实，利用该微流控装置可以实现白细胞的高效快速过滤分离，进而将血液中白细胞浓度降低至原来的千分之一。

白细胞外渗迁移通常由趋化因子介导，通过感知趋化因子浓度迁移到特定位置（如损伤或感染组织）来完成免疫功能。白细胞迁移失败或迁移到不当位置会对人体产生伤害。因此，利用微 流控装置对白细胞外渗迁移影响机制非常重要。Cheng 等人设计了一种基于水凝胶的微流控装置来研究白细胞的迁移。该装置采用三通道设计，在一个外通道中设置恒定的趋化因子浓度，在另一个外通道中设置空白缓冲液。这样的设计可以避免力学刺激影响化学刺激，进而防止剪切应力影响趋化因子梯度分布。通过该装置，他们成功检测到了白细胞的趋化反应。炎症与许多疾病（如动脉粥样硬化）相关，最初的炎症反应包括白细胞沿着毛细血管后静脉粘附到感染部位的血管内皮并进行滚动，这一粘附滚动过程由多个不连续步骤组成，受多种因素包括趋化因子影响。因此，研究各种因素对白细胞粘附滚动的影响具有重要意义。Schaff 等人设计了一种平行板几何结构的微流控装置，可用于直接观察白细胞在微通道中的粘附滚动情况。利用该装置，他们研究分析了不同趋化因子浓度下白细胞的粘附滚动和停滞情况，认为从血液中转移白细胞受趋化因子与整合素等因素影响。

与正常生理条件下的白细胞运动行为相比，病理条件下的白细胞在边集、滚动、外渗和迁移等运动行为上有不同的表现。因此，有必要研究病理条件下白细胞的运动行为以及其受药物作用的影响。Fay 等人设计了两个独立的体外微流控芯片系统，分别模拟毛细血管和静脉，并研究了两种白细胞边集与粘附的情况。利用仿生毛细血管微流控装置，他们通过测量白细胞通过一定距离所需的时间来评估白细胞的边集程度；利用仿生静脉微流控装置，他们通过测量白细胞与通道壁的间距来评估白细胞的边集情况。通过对比实验，他们发现地塞米松等抗炎药物可以抑制白细胞的边集行为，这对揭示白细胞动态行为变化的影响机制具有重要意义。另外，Tsai 等人设计了一种微流控器件来模拟毛细血管后小静脉和小动脉形成的分叉血管网络，并在生理和病理血流下分析白细胞-内皮细胞粘附行为对微血管堵塞及血栓形成的影响。他们发现，白细胞-内皮细胞粘附及多细胞聚集等力学因素可以对包括血流速在内的多种血流动力学指标带来显著影响。同时，他们还定量分析了羟基脲药物对微血管堵塞的影响，发现该药物可以降低微血管栓塞的几率，从而为解释该药物的临床疗效提供了细胞水平的数据支持。

2.2 白细胞在微管道流动变形行为的数值模型模拟

白细胞是人体最主要的免疫细胞，担任着免疫防御、免疫稳定和免疫监视的角色，研究其边集、迁移及渗出等动力学行为对深入理解其免疫功能至关重要。数值模型模拟技术的应用可以帮助我们深入理解细胞水平上白细胞的运动行为，包括细胞流动变形行为、边集及粘附等过程。

研究表明，白细胞的边集行为受多种因素的影响，包括红细胞压积、局部血流速率和速度分布、以及红细胞-红细胞的聚集性能。显然，通过微流控实验研究分析这些影响因素对白细胞行为的影响有很大的挑战。因此，研究人员开始利用数值模型模拟来深入探讨相关的白细胞边集/流动规律及影响机制。Fedosov 等人模拟了白细胞在不同红细胞压积下的边集行为，发现红细胞的高压积有助于白细胞的边集。他们认为，这是因为高压积的红细胞具有更大的聚集区域和更紧密的堆积性，将白细胞推向血管壁面的力则会更大，从而使得白细胞更容易边集。Freund 等人用29个红细胞和1个白细胞模拟了白细胞在微血管中的边集行为，他们探究了血液流速对白细胞边集的影响，发现白细胞边集的位置与血管中的无细胞层（Cell-free layer, CFL）息息相关。

白细胞的边集与迁移受到红细胞压积的影响，同时与血管中的无细胞层的流速息息相关。这些理论结果为仿生微纳机器人的研发提供了新的思路。例如，Alapan 等人研发了一种磁性驱动的微纳机器人，这种机器人模仿白细胞的边集和迁移实现靶向递药。但这样的仿白细胞微纳机器人在血管内的生物力学和生物流变学对受控的剪切应力的响应机制目前尚不清楚。基于此，Qi 等人基于耗散粒子动力学方法构建了类似的仿白细胞微纳机器人模型，以研究其在不同剪切应力水平下的动态性能（如图 4）。他们的仿真结果表明，磁转矩可以精准控制被磁化的微纳机器人在血管内的顺流及逆流运动，且逆流速度随着磁转矩强度的增大而增大。此外，他们还发现流动的红细胞会与逆流运动的微纳机器人发生碰撞，进而阻碍其运动。这些模拟结果有助于理解单个微纳机器人在血流中的爬行动力学行为，为促进仿生微纳机器人在靶向和局部治疗中的设计提供了一定的理论指导。

图 4 仿生白细胞微型机器人在微管道中的流动变形的数值模型模拟

3 微流控芯片系统及数值模型模拟在干细胞流变学行为研究进展

3.1 基于微流控芯片系统的干细胞变形特性研究

用于治疗的干细胞被注射入血液循环系统后将会有什么样的经历和命运？了解干细胞在微血管内的“冒险经历”对提高干细胞疗法的疗效有着重要的意义。干细胞直径通常为 15-30 微米，这一数据显然大于毛细血管直径（3-10 微米），意味着进入微血管的干细胞易造成血管堵塞，直接导致细胞无法进入下一步的归巢环节。因此，了解干细胞的变形性能对提高干细胞疗法的疗效至关重要。微流控细胞变形性检测方法因其操作简单、无需标记样本、成本低、通量高的特点成为了单细胞力学表型分析的有力工具，在研究细胞变形过程中的生理状态和病理变化方面表现出了巨大的潜力。目前，基于微流控技术的细胞力学表型测量方法主要有三种： 收 缩 变 形 流 式 细 胞 术 （ Constriction deformability cytometry，cDC）、流体剪切变形流式细胞术（Fluid shear deformability cytometry，sDC）和拉伸变形流式细胞术（Extensional flow deformability，xDC）。这三种典型微流控流式细胞术是在流场中分别利用压力、剪力、拉力驱动目标细胞产生不同程度的变形，从而量化其变形能力。通过以上三种方法，可以直接观察和测量得到细胞的刚度。Ni 等人在 cDC 基础上设计了一种多通道并行的微流控芯片用以测试敲除Ptpn21蛋白的造血干细胞的流动变形能力，发现Ptpn21-/-的造血干细胞通过渐缩的微通道时的流动速度明显比天然造血干细胞的速度更快，且更不易粘滞在微流控通道内。

不同类型的干细胞具有不同的细胞刚度，即使是同类型的干细胞，在健康状态和病理状态下也有比较大的差异。长期以来，学界致力于在人类骨骼中鉴定并分离出各种类型的干细胞，却一直难以确定可靠的细胞表面标志物、合适的组织解离方案和功能性干细胞试验。Xavier 等人在经典的 sDC 基础上运用了实时可变形流式细胞术（Real-time deformability cytometry， RT-DC）分别测量了骨骼干细胞（间充质干细胞的一个亚群）、间充基质细胞以及白细胞的力学表型，发现这三类细胞在细胞尺寸、变形程度上表现出了显著的差异。实验表明骨骼干细胞的细胞刚度大于其他两类细胞，利用细胞刚度差异来提高骨骼干细胞的分离效率具有显著的生理治疗意义和临床转化的潜力。

干细胞的刚度和尺寸均高于红细胞，因此在微血管内流动输运显然存在困难。对大鼠冠状肌从小动脉到小静脉的动脉内的输运过程中，跟踪显示 92%的间充质干细胞在毛细血管前水平的血管中发生了阻滞，导致局部缺血。Lipowsky及其团队利用瞬态过滤实验（Transient filtrationtest）给出了间充质干细胞所能通过毛细通道的直径与压强差之间的关系；同时，他们发现间充质干细胞在穿越与毛细血管尺寸相当的通道时所需的驱动压差超越了体内真实毛细血管中的压差数值，从而导致极高的微血管堵塞率；此外，他们还发现在细胞直径与毛细通道直径比大于1.56 临界值时，能够驱动间充质干细胞通过毛细通道的压差值迅速上升，这与细胞直径与细胞核直径的平均比值（1.62±0.23SD）有直接关系。根据这一发现，许多学者开始研究干细胞的细胞核，并得出共同的结论：细胞核是决定干细胞力学特性的核心结构。于是，人们开始通过改良微吸管技术（Micropipette aspiration  technique）来提高测量干细胞及其细胞核力学表型的效率。Davidson 等人开发了一种高通量的新型微流体装置和半自动成像分析通道（如图 5a）来探测完整细胞中随时间变化的细胞核力学行为。这种高通量的微吸管芯片可以在完整干细胞中以高分辨率观察和量化的细胞核的变形，适用于并行测量四组不同类型的多个细胞数（每组 18 个通道），比传统的单细胞微吸管实验或原子力显微镜技术高 1-2 个量级。这种多通道微流控芯片设计允许快速加载、清洗细胞并进行测量，在提高测量效率的基础上最大限度地减少细胞簇的堵塞。

3.2 基于微流控芯片系统的干细胞迁移行为研究

那些顺利通过微血管关卡的干细胞将面临更大的挑战——迁移，即穿越直径仅为 2-5 微米的血管内皮细胞间的狭缝，并爬行至炎症组织部位。干细胞迁移对其生理和病理过程都至关重要。为了在体外模拟这一特殊过程并量化细胞的主动迁移能力，Tong 等人设计了一种具有迁移室的微流控芯片系统，该迁移室利用可自我维持的趋化因子浓度梯度来诱导细胞在三维受限空间内的迁移运动。然而，该迁移室通道的几何形状与真实的体内生理微环境几何形状存在较大差异，基于此，Davidson 等人对细胞迁移微流控芯片设计进行了改良，使其微通道能够模仿体内内皮细胞间狭缝的尺寸，从而能够观察到干细胞通过狭窄通道时产生的变形，以预测间充质干细胞在内皮细胞间狭缝处的挤压情况，量化间充质干细胞及其细胞核在仿生微通道中的迁移能力（如图 5b）。类似地，他们团队发现细胞核的变形能力是限制细胞在狭窄通道（2-5 微米）中迁移的一个重要因素。为了提高该微流控系统的检测分析能力，Joshua 等人开发了一套 MATLAB 程序，用以追踪细胞核在仿生狭缝中的运动轨迹、迁移时间和迁移成功率，同时可以检测细胞及其核的完整性，将检测分析时间从数周缩短到了数小时，并且可消除手动测量引起的误差。

为了进一步提高干细胞的迁移效率，Wang等人通过离心将间充质干细胞进行去细胞核处理，并对去核间充质干细胞（Cargocyte）进行了迁移能力测试（如图 5c）。通过与天然人源间充质干细胞（hT-MSC）的迁移实验结果对比，发现Cargocyte 有效地通过了狭窄通道，而 hT-MSCs则经常被捕获在狭缝中。这一结果表明，去核干细胞比天然干细胞具有更好的变形能力，这与先前的研究结果一致：细胞核的硬度是周围细胞质的 2 至 10 倍，并且细胞核与细胞骨架的物理解耦足以增加细胞骨架的变形能力。

微流控系统的不断发展为研究人员提供了一个更真实、可控的仿生实验平台，帮助揭示干细胞生理行为中的关键问题，对干细胞疗法的改良工作提供了大量潜在的策略。

图 5（a）高通量微吸管实验装置示意图：通过加载在三个位置的不同压强实现负压操作。干细胞的荧光染色图像中，红色荧光标记的组蛋白表示细胞核，绿色荧光标记肌动蛋白表示细胞质。（b）基于微流控芯片的干细胞跨内皮迁移装置。两个红色圆柱形储液池设计用于产生趋化因子浓度梯度，有利于干细胞在绿色的空间受限区域中迁移。（c）hT-MSCs 和 Cargocyte 在微通道中沿 FBS 梯度沿缩窄移动的延时图像序列。红色显示的是细胞骨架，蓝色显示的是细胞核。标尺长度为 50 μm。

根据细胞相关生理参数在细胞整体系统水平建立细胞数值模型，对于进一步理解细胞流变行为和生理状态规律，预测各种环境扰动对细胞功能的影响并指导设计干细胞微流控实验具有重要意义。鉴于数值模型模拟在红细胞、白细胞流变行为研究中已经有了广泛应用，学者们也开始尝试将数值模型模拟方法与微流控实验结合起来，对干细胞流变和归巢行为的力学影响机制进行深入研究。Qi 等人基于耗散粒子动力学（Dissipative particle dynamics，DPD）方法建立的干细胞归巢行为数值模型作为研究干细胞跨内皮迁移实时动态行为的模拟平台，通过大规模并行计算实现了干细胞在流体力推动情况下挤压通过仿生内皮细胞间狭缝的动态过程观测，同时，他们实现了干细胞跨内皮迁移行为发生时细胞及其核的表面剪切应力变化、流场信息变化的数据捕捉、传输及自动入库功能。现在，数值仿真技术与微流控芯片技术结合的研究方法应用得越来越广泛，微流控实验允许研究人员精确控制细胞所处微环境，数值仿真可以帮助研究人员快速进行参数优化，以找到最佳实验条件，从而节省时间和资源，减少实验次数的同时还能提高实验效率。此外，数值仿真可以深入人们对细胞变形、迁移的理解，有助于解释实验观察到的现象。

4 结 论

随着技术的不断进步和创新，微流控技术将在细胞力学和生物医学研究领域发挥越来越重要的作用，为人们对生命科学的理解和医学诊疗技术的进步带来更多的可能性。在本综述中，我们总结了微流控技术以及基于微流控的数值仿真技术在血细胞及干细胞流变学行为方面的研究进展，并简单展望了未来的发展趋势。首先，我们介绍了微流控技术的基本原理，并阐述了其在生物医学工程领域的重要作用。随后，我们围绕微流控技术及基于微流控技术的数值仿真方法在血细胞和干细胞两大研究领域的应用展开了详细讨论。在血细胞领域，我们强调了微流控技术在红细胞变形性分析和白细胞迁移行为研究中的关键作用。研究人员通过微流控芯片系统可以模拟不同的血流微环境，实时观察血细胞的变形、迁移以及与周围环境的相互作用，为生理与病理条件下的血细胞力学和血流动力学的研究提供了新的视角。在干细胞领域，我们强调了微流控技术在研究干细胞力学特性和血流微环境对干细胞归巢行为影响方面的应用。微流控技术使得研究者可以更直观地观察和分析干细胞的变形性、迁移能力以及与周围细胞的相互作用，为再生医学和组织工程领域的研究提供了新的思路和手段。基于微流控实验的数值仿真在这一领域的发展帮助研究人员们快速优化实验条件，找到潜在的关键参数，能够有效提高实验效率。

微流控芯片技术的微尺度、微循环的特性，可以精确考察控制单细胞尺度微环境; 但目前还难以满足血管力学特性的模拟，在体外模拟血管壁弹性、内皮粘附能力和渗透等功能方面仍面临一系列挑战。同时，由于血细胞和干细胞所处的细胞力学微环境十分复杂并且在持续变化，微流控芯片还不能完全复现细胞所处小生境。随着增材制造技术和 3D 打印等技术的蓬勃发展，人们有望构建仿真人造血管等方式来实现生物材料的非线性和各向异性，从而为血细胞及干细胞流变学行为分析的后期研究和应用提供有力实验平台。此外，GPU 加速的大规模并行数值模拟技术、机器学习等新兴方法与微流控技术的结合，也会为未来的细胞流变学领域的基础研究及干细胞疗法的临床应用研究提供有力支撑。

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