原创 基于玻璃基底的细胞培养芯片研究

近几年来，微全分析系统技术日益受到人们关注,广泛应用于生化分析和细胞学研究领域。μTAS技术应用于细胞学研究的一个重要发展方向是开发细胞培养微系统,用于细胞迁移,细胞分化贝药物筛选等。与常规细胞体外培养技术相比,利用细胞培养微系统培养细胞能够较好地模拟细胞体内生长的微环境。然而,在设计细胞培养芯片时,必须考虑芯片材料的生物兼容性、培养液流动导致的机械力对细胞的影响和有效成分的传递输送等因素其中,如何通过简单快速的微细加工工艺加工生物兼容性良好的材料，是需要解决的首要问题。

目前用于加工细胞培养芯片的材料主要有硅、玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS等聚合物材料）。PDMS芯片通常采用复制压模技术制作",能够实现微米级图案的高保真复制,并且具有良好的生物兼容性,可直接培养各类细胞。但PDMS是弹性材料，易受有机试剂作用产生微通道变形、溶胀等现象;且PDMS管道表面为疏水性,很难润湿亲水性溶液,在培养液进样过程中容易产生气泡而损伤细胞。

与PDMS材料相比,玻璃材质芯片具有良好的亲水性能、力学性能,且制作设备与传统集成电路(IC)工艺设备相兼容。但目前制作玻璃芯片，是在玻璃基底上溅射一层金属或多晶硅等薄膜材料作为刻蚀掩模层,然后进行湿法或干法刻蚀,最后在超净环境中利用高电压或高温进行键合同整个加工工艺复杂，价格昂贵。

为了综合利用玻璃材料和PDMS材料的优点，我们提出了一种基于玻璃湿法腐蚀过程中的钻蚀效应叫,廉价、快速地制作玻璃细胞培养芯片的方法。以商品化的氧化铟锡透明导电玻璃为芯片基质，以一层AZ4620光刻胶作为玻璃刻蚀的掩模层,以BOE液为玻璃腐蚀液,通过上胶、曝光、显影、腐蚀、去胶、键合等步骤获得细胞培养芯片。其中,盖片仍采用PDMS材料,以利用它的透气性特质。采用ITO玻璃有利于集成加热系统,满足细胞长期观察和记录细胞活动的需要。最后,将该芯片与温度控制系统、视频观察系统等整合,培养猪髂骨动脉内皮细胞,证实了该方法的可行性和系统的稳定性。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞培养芯片的基质材料为商品化的ITO玻璃;刻蚀掩模层采用正性光刻胶AZ4620(AZ photoresist products美国):PDMS单体为Sylgard184 Dow Coming美国);细胞培养芯片加工过程中所用化学试剂均为分析纯产品,玻璃腐蚀液为BOE液。

1.2微流控芯片的加工

以ITO玻璃为基质材料的细胞培养芯片制作主要包括掩膜板制作、ITO玻璃清洗,曝光、刻蚀、键合等步骤,见图1。

1.2.1掩模板制作 芯片掩模板如图2所示。进样孔1、3之间距离为14mm,用于导入细胞,管道狭窄处宽度为200μm,其他为细胞培养区域，宽度为800 μm:2.4间管道为培养液导入通道,宽150 μm,总长14mm。培养液通道和细胞培养区域之间距离为190μm,用于加工后续的坝型”结构。

1.2.2 ITO玻璃清洗 将ITO玻璃先用丙酮和酒精超声清洗,再用去离子水冲洗干净,放入130C的烘箱中烘烤1h，去除附着在玻璃表面的水蒸汽。

1.2.3曝光、显影 ITO玻璃的一侧已溅射一层厚度为35mm的ITO薄膜,其功能为导电发热,另一侧则与普通玻璃无异。在没有 ITO薄膜的玻璃一侧甩涂AZ4620光刻胶。甩胶结束,将ITO玻璃置于80C烘箱内软烘30min此时光刻胶厚度为6~7μm。软烘结束,利用光刻机对玻璃基底进行紫外曝光。曝光后的ITO玻璃用显影液AZ400K显影，显影过程中不断晃动ITO玻璃,使显影液与被曝光的感光胶充分接触,加速感光胶和基底的分离。显影至被曝光部分的光刻胶完全去除为止。

1.2.4刻蚀 将显影完成后的ITO玻璃置于130C的烘箱中硬烘30min硬烘过程可以降低光刻胶与玻璃基底的残余应力,蒸发去除光刻胶内的有机溶剂，增加光刻胶掩模层与玻璃基底表面的黏附力。由于ITO薄膜耐腐蚀效果较差,其在以50:503比例配置的HO HCIHNO腐蚀液中耐受时间约为40s因此,在硬烘完成,进行湿法腐蚀之前,需要对玻璃基底的ITO薄膜进行保护,以避免在刻蚀过程中BOE液将此薄膜腐蚀去除。保护方法如图1⑤所示,将PDMS单体和固化剂以10：1混合均匀,脱气处理后浇注在ITO薄膜一侧，80C固化1h待固化完成,将此玻璃基底置于BOE腐蚀液中进行刻蚀，刻蚀过程中通过磁力搅拌器不断搅拌,以形成所需要的微管道结构。腐蚀完毕,去除用于保护作用的PDMS薄层,即得到已刻蚀好微管道的玻璃基片,如图3所示。

1.2.5 PDMS 薄膜盖片制作将PDMS单体与固化剂按10:1的比例均匀混合后,脱气处理。将脱气处理后的PDMS浇注在水平放置的载玻片上，80℃固化1h。固化完成,切割成合适的大小用于后续与玻璃基片的键合。PDMS薄膜厚度为1mm。

1.2.6 键合 刻蚀完成后的玻璃基片上的通道为开放性结构，将其与其他平整表面键合即可形成密闭的培养通道。将此玻璃基片与上一步骤制得的PDMS薄膜置于等离子体刻蚀仪内，抽真空后通入氧气,施加射频电压,取出玻璃基片和PDMS薄膜，小心粘合即完成两者的不可逆键合。

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