原创 空间光调制抗衍射光片流式细胞术中的微流控芯片

流式细胞术是一种广泛而强大的技术，其分辨率取决于其准确区分荧光阳性人群和阴性人群的能力。然而，在进行常规流式细胞术的测量时，大多数信息丰富的结果都被丢弃了，例如未纯化生物样本中标记的外泌体的细胞大小、形状、形态和分布或位置。在此，我们提出了一种使用具有各向异性特征的抗衍射光片来激发荧光标签的新方法。由抗衍射贝塞尔-高斯光束阵列组成，光片为12μm长，12μm高，厚度约为0.8μm。因此，激发荧光信号的强度分布可以反映尺寸，并允许样品在0至10μm通过微流控芯片中的流体动力学聚焦进行运输。采样率为500 kHz，在不牺牲空间分辨率的情况下提供高吞吐量的能力。因此，所提出的抗衍射光片流式细胞术（ADLSFC）可以获得比传统方法更具信息量的结果，并且能够提供多种特征，有助于将目标样品与复杂背景区分开。

流式细胞术（FC）是一种强大的分析技术，能够快速分析流过单个或多个激光截距点的溶液中的细胞和颗粒。由于其计数、表征和分类细胞的能力，它已被广泛应用于细胞分析和疾病诊断。

在过去的三十年里，世界各地的几个研究小组参与了微流控流式细胞术的研究。已经开发了各种类型的流式细胞仪，包括声聚焦细胞仪、细胞分选仪、成像细胞仪、质量细胞仪和用于珠阵列分析的细胞仪。声聚焦细胞术使用超声波来帮助聚焦细胞进行激光询问。优点是它不需要高速或大体积的鞘流。然而，它的吞吐量低，设备复杂庞大。细胞分选机通过液体样品流的高频振荡产生液滴来分离细胞。然后，液滴被赋予正电荷或负电荷，并穿过金属偏转板。最终，它们会根据电荷被引导到特定的收集容器。细胞分选机具有高分离纯度和灵活性，但它没有样本详细信息。

结合荧光显微镜，成像流式细胞术（IFC）允许在单细胞水平上快速分析生物样本的形态和多参数荧光，而IFC的高空间分辨率只能通过牺牲吞吐量来实现，即每秒分析的生物样本数量。例如，使用电荷耦合器件（CCD）对一个细胞成像所需的时间跨度可以短至1ms，这意味着最大吞吐量仅为每秒1000个细胞。此外，IFC需要较大的存储空间，分析时间较长。

质谱仪结合了飞行时间质谱和流式细胞术。细胞用重金属离子标记的抗体（通常来自镧系元素家族）而不是荧光抗体标记，并使用飞行时间质谱法检测。由于不使用荧光标记，因此不需要光补偿。然而，样本细胞被破坏，无法在下游进行分析。使用细胞仪进行珠阵列分析是一种检测特异性结合到样品上的荧光珠的技术。通过评估荧光强度，可以量化与珠子相关的样品数量。

传统的流式细胞术通常“体积庞大”，分离纯度相对较低[1]。随着微流体和微型技术的快速发展，在过去的十年里，便携式、高度集成和易于操作的流动系统得到了发展。例如，Jiang等人通过耦合电动诱导的压力驱动流进行荧光颗粒计数，设计了一种小型化的双波长荧光检测芯片。Kanwa等人使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造了一种形状像葫芦的微流体装置，用于捕获和定量分析染色的外泌体。Lee等人提出了一种声学纳米过滤系统，该系统以连续和非接触的方式分离特定尺寸的微囊泡。这些新的细胞检测设备丰富了流式细胞仪设备家族。

然而，FC的性能是关键参数之一对其他参数的折衷，从而限制了它的应用。生物样本的形态特征通常是帮助区分一个群体与另一个群体的关键参数之一。例如，大肠杆菌是一种典型的革兰氏阴性杆菌，其长度在1到几十微米之间，反映出独特的活性。在采用椭圆形和球形焦斑的传统FC中，无法检测到细胞在通过截距点时的大小、形状和方向的差异，这使得区分活性细胞变得困难。相比之下，当非球形物体经过时，具有大纵横比的焦斑（例如，光片）会产生独特的强度分布（图1）。Miura等人将光片实现为定制的IFC，旨在将每个图像像素的荧光强度提高约10倍。据我们所知，这些研究人员都没有利用高纵横比的焦斑来提高FC的空间分辨率。

在这项研究中，我们设计了一种新型的流式细胞术系统，使用高度各向异性和抗衍射的光片（ADLS）作为激光拦截点。ADLS是由空间光调制器（SLM）通过条纹分裂相位（SSP）方法产生的平行且紧密排列的贝塞尔-高斯光束形成的。贝塞尔-高斯光束是一种具有矢量偏振的光束。它具有几个惊人的特性，例如抗衍射、自愈、大焦深和低干涉，即使其中两个是平行且紧密放置的。因此，可以使用具有大面积和良好均匀性的贝塞尔-高斯光束阵列来生成ADLS。此外，自我修复功能使ADLS在通过复杂解决方案时不会失真。在目前的研究中，ADLS的尺寸为12μm长，12μm宽，0.8μm厚度。该规范使我们能够以亚微米的空间分辨率测量大型和小型物体。穿过不同大小、分布甚至姿态的物体会产生不同的强度分布，可以对其进行计数和分析。对于传统FC来说，这是无法实现的。结合光电倍增管和高速数据采集模块，500 kHz可以容易地实现采样率。最大计数率可以是每秒至少104个事件。因此，所提出的方法大大提高了传统FC的空间分辨率，适用于对具有复杂物理和化学特征的生物样本进行分选和分析。

系统设置

实验系统如图2a所示。在这个实验中，473nm，连续波激光器作为光源。激光束首先被空间滤光片过滤，然后被扩束器准直。通过分束器进一步调整光束，和偏振器。穿过偏振器后，线偏振光束的方向与SLM的液晶的方向平行。调制光束进一步被引导到倒置荧光显微镜系统中，并用物镜聚焦，以在焦点处产生ADLS。显微镜有一组滤光片，包括二向色镜和带通滤波器，从激发光中提取荧光。

使用流式细胞术制造的微流控芯片中的ADLS实现颗粒检测、测量和分析（图2a插图）。微芯片有三个入口。A和C入口用于水流，而B入口用于样品溶液。这三种溶液在接头O处接触，并在下游形成鞘流。微通道AO、BO和CO为100μm宽度为10μm在高度上。试验箱，即DO部分，为50μm宽度为10μm在高度上。

微流控芯片的空间位置由纳米压电台改变，使ADLS位于微通道的中心。当荧光颗粒以给定速度通过ADLS时，ADLS激发荧光颗粒发出荧光。荧光信号依次通过带通滤波器和二向色镜，然后被探测器捕获。使用显微镜中的分束器，20%的荧光被SCMOS相机捕获，以监测ADLS。剩余的80%荧光被聚焦到光纤中，并用光电倍增管（PMT）。ADLS被放置在测试室中，以检测射流中的样品，如图2c、d所示。相比之下，零阶光点被聚焦到鞘流中。只有通过ADLS的样品的荧光才能聚焦到光纤中。零级光激发的可能荧光已被阻断。

PMT与放大器结合，将荧光信号转换为电信号。然后，在嵌入式板上的16位模数转换器收集并转换为数字原始数据后，数据最终被发送到计算机进行处理和分析。系统的采样率高达500 kHz.

微流控芯片的制备

根据图3所示的程序，通过使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术制造微通道。首先在硅晶片上使用负性光致抗蚀剂SU-8 3025制造沟道层。10分钟后在预烘烤过程中，使用接触掩模对准器将涂有光致抗蚀剂的晶片暴露于紫外光下。后烘烤后通过开发，得到了模板。随后使用PDMS复制模板的结构。PDMS微通道进一步粘合到载玻片上，并冲压有入口和出口，以形成所需的微流体芯片。

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