原创 微液滴中的单细胞封装技术

微液滴中的单细胞包封主要是通过流体动力学和表面张力操纵来实现的。液滴尺寸由连续相的粘度、界面张力、微通道尺寸以及分散相和连续相的流速决定，液滴直径从几十微米到几百微米不等。单细胞微滴具有高通量和小尺寸的特点，使其适用于高通量单细胞分析。然而，单细胞的包封通常是随机的，特别是当基于通常用于单细胞分析的被动液滴生成方法时。需要加强对单细胞包囊的控制。为了提高实际应用的封装效率，通常会进行随机封装，然后根据工艺要求进行进一步筛选。此外，通道结构经过定制，以确保细胞的最佳排列和封装。

随机单细胞包封使用微流体液滴技术生产液滴面临着一个固有的复杂性，即溶液中细胞的分布通常是不均匀的，包封是一个随机过程。因此，无限稀释的细胞悬浮液中每个液滴封装的细胞数量将遵循泊松分布，其中液滴中的细胞数量由液滴的大小和悬浮液中细胞的密度决定。增加细胞密度或液滴大小会增加给定液滴包封多个细胞的机会。例如，在细胞悬浮液浓度为7.5×105个细胞/mL时，在体积为33、180、320 pL时，含有多个细胞的概率分别为0.03、0.83和2.45%（图4A）。预测的泊松分布与液滴形成后获得的实际分布非常一致。一般来说，大多数液滴会有一个细胞或没有细胞，只有少数液滴会包含多个细胞。随机确定的包封在液滴内的细胞数量的变化将对研究单个细胞的能力产生重大影响。

在随机包封方法中，每个液滴的细胞数量取决于细胞悬浮液的初始浓度和液滴体积，但将遵循高度随机的分布，其中单细胞液滴的比例较低。因此，必须进一步加强控制单个液滴内包封的细胞数量的程度。为了提高单细胞包封的效率，一些研究人员采用了随机包封后分选的方法。例如，Navi等人提出了一种使用流聚焦微流体装置在水滴中产生水的方法。87在他们的装置中，铁磁流体被集成到全水滴微流体系统中，以实现单细胞包封和空液滴的抗磁性分离。与现有平台相比，他们的平台的主要优势是良好的生物相容性，不会对细胞造成伤害，芯片简单易操作。通过使用反磁力来操纵细胞包封液滴，液滴不需要被磁化，因此细胞不会与磁性材料直接接触，从而能够以100%的分离纯度进行未标记的细胞操作。这种简单且生物相容的微流体平台非常适用于单细胞分析。此外，Nan等人引入了一种微流体系统来生产和分类单细胞微胶囊（图4B），88通过该系统，他们能够在微流体装置中实现微滴和微凝胶的高通量制备。重要的是，芯片上的分选电极用于完成单细胞微胶囊的选择，同时将其转移到培养基中。在每毫升3.05×106个细胞的细胞密度和50μm的液滴直径下，它们实现了16%的单细胞包封率。分选后，单细胞包封率提高到80%以上。该方法可用于整合液滴凝胶化、单细胞负载微凝胶分选和转移到培养基中，以实现单细胞水平的高通量分析，从而全面评估细胞异质性。最近，Shum的团队开发了一种基于微流控液滴和荧光激活分选技术组合的按需液滴收集系统，该系统可以连续定量地将所需的液滴收集到微管中，而不会造成明显的样品损失或微流控中断（图4C）。具体来说，他们的方法允许在液滴产生后交替地对每个分支通道进行分选、分布和收集，以实现单细胞液滴的连续收集。然后将包封的单细胞液滴有效地捕获在培养板上，并进一步培养以研究细胞行为并充分分析单个细胞的特异性。通过使用荧光激活液滴分选和阀驱动分配，该方法可以在200 Hz以上的频率下筛选单个细胞，单个细胞的包封效率和回收率分别为98.5%和99%。这种方法比传统的人工细胞选择和激光捕获显微切割技术更有效，在单细胞水平分析任务中具有广阔的应用前景，如免疫学中的细胞因子检测、蛋白质组学中的质谱和转录组的全基因组测序。

受控的单细胞包封如前所述，悬浮液中的细胞随机包封成液滴的过程结果通常遵循泊松分布，这通常会导致相对较低的单细胞包封率。为了提高单细胞包封效率，可以在弯曲的微通道中使用惯性测序将单个细胞包封在液滴中，通过将惯性力和Dean力均匀地结合到空间细胞的过程。通过将细胞流动的周期性与液滴的产生相匹配，可以减少空液滴和多细胞液滴的数量，提高单细胞的包封效率。例如，Edd等人报道了高纵横比微通道中液滴对单个细胞的顺序包封。在他们的研究中，细胞自组织成两股均匀间隔的流，单细胞直径占通道宽度的一半以上。这确保了设计的通道宽度只能容纳单行细胞，因此细胞进入频率与液滴产生频率一致。这种方法可以通过克服泊松分布的固有局限性来有效地提高封装精度，以确保几乎每个液滴都包含一个细胞，从而实现高封装效率（97.9%).

Kemna等人率先使用Dean流形成单细胞排列，随后进行单细胞包封（图4D）。 Dean流可以诱导细胞在平衡的位置聚集，以实现所需的空间排列，确保细胞流动周期与液滴产生频率一致，并将包封效率提高到77%。他们的方法利用微观结构来控制细胞的规则排列，然后完成单细胞的封装，有效地提高了单细胞液滴的比例。然而，这不仅需要控制Dean流的形成，还需要细胞和液滴频率的同步，这很难实现。

他的团队将螺旋和蛇形通道结合起来，有效地聚焦细胞和微珠。他们使用他们的方法包封条形码微珠和人类小鼠细胞，然后通过测序表征细胞异质性（图4E）。使用这种方法，与传统的Drop-seq设备和仅用于聚焦微珠的设备相比，他们的细胞利用率分别提高了300%和40%。结果支持其微流控芯片的操作效率得到提高。这种芯片设计具有实现高效单细胞表达谱的巨大潜力。

水凝胶中的单细胞包封

除了模拟三维（3D）微环境以支持细胞的活动和功能外，将单细胞包裹在微尺度水凝胶中还可以作为进行独立细胞操作和监测的良好工具，这对于探索类体内微环境中的单细胞活动至关重要。与单细胞包封的液滴不同，微凝胶可以形成3D网络结构，其形态可以通过调节凝胶单体或聚合物的浓度来控制。这确保了氧气、营养物质和生长因子的供应，以及细胞代谢废物的及时排出，这使得在凝胶微球中培养细胞一段时间成为可能。通过应用适当的化学或物理方法，液滴中的未固化凝胶可以被激活转化为凝胶微球。化学凝胶化可以通过光诱导交联、氧化还原诱导聚合或分子间化学交联反应来实现。虽然通过化学凝胶化制备的水凝胶具有更高的稳定性、更长的耐用性和更好的机械性能，但使用化学交联剂可能会导致细胞毒性，一些化学反应的低特异性可能会导致与蛋白质和细胞的意外相互作用。物理凝胶化可以经由热介导的溶胶-凝胶转变或离子之间的物理交联反应来实现。在热产生的凝胶化过程中，当温度高于凝胶化温度时，含有聚合物的液滴处于液态，将温度降低到凝胶化温度以下会导致聚合物的线性分子聚合。形成凝胶网络结构，诱导液滴固化成凝胶微球。另一种凝胶化方法是基于静电相互作用的物理交联。一种常见的物理交联凝胶化方法是通过藻酸钠葡萄糖单元中的钙离子和羧酸基团的螯合将藻酸钠转化为藻酸钙凝胶。虽然物理凝胶化过程可以在温和的条件下进行，但物理水凝胶网络在组织内的机械强度通常较低，稳定性较差。因此，物理方法更适合包封细胞，并且比化学交联方法具有更好的生物相容性。两种类型的材料——合成聚合物和天然聚合物——用于生产包封单细胞的水凝胶微球。

使用合成聚合物进行包封在微流控液滴技术中，合成聚合物被用作生产细胞包封凝胶微球的材料，该微球可以通过化学修饰直接控制细胞微环境。常用的合成聚合物包括聚（N-异丙基丙烯酰胺）和聚乙二醇二丙烯酸酯。合成聚合物在分子量、结构和交联密度方面具有可调节的性能，可用于生产具有不同机械性能的凝胶微球，通常比天然水凝胶更强。含有薄（几微米）半渗透外壳的合成水凝胶胶囊与基因组扩增等多步分子生物学检测兼容。然而，这些合成微凝胶是不可生物降解的。

一般来说，通过紫外线聚合的合成聚合物被应用于形成凝胶微球以包封细胞。含有光引发剂、交联剂和单体的细胞悬浮液用作分散相。微滴在微流控芯片中产生后，光引发剂在紫外光照射下，在交联剂的作用下促进单体的交联反应，产生凝胶微球。Kamperman等人使用聚乙二醇二丙烯酸酯作为原料，在微流体流聚焦装置中以1 kHz的包封速度形成包封有多能性人间充质干细胞或牛软骨细胞的微滴（图5A）。通过下游通道中的外部紫外光源对微滴进行光交联，以制备细胞负载微凝胶并保持高细胞活性。通过流式细胞术分选的单细胞微凝胶（纯度>90%）然后与聚乙二醇二丙烯酸酯和藻酸盐等不同的生物相容性材料混合，以创建各种模块化生物墨水，可用于3D打印，以单细胞分辨率重建细胞微环境。然而，紫外线照射对细胞有一些毒性作用。解决这个问题有两种潜在的方法：（1）可以减少紫外线照射的暴露时间或调整紫外线波长；（2） 可以开发新的聚合方法来避免细胞损伤。

使用天然聚合物进行封装与合成聚合物不同，天然聚合物来源于生物体自身产生的代谢物。近年来，天然聚合物因其良好的生物相容性和温和的聚合条件而被广泛应用于细胞封装。用于单细胞包封的天然聚合物包括海藻酸钠、琼脂糖、明胶、胶原蛋白、和透明质酸，其中海藻酸钠，琼脂糖和明胶是最常用的95种。

海藻酸盐是一种从褐藻中提取的水溶性线性大分子多糖化合物，由不同比例的β-d-manuronic和α-l-古洛糖醛酸单元形成。108古洛糖核酸单元中的羧基可以与钙、钡和镁等二价阳离子反应，导致快速凝胶形成。由于海藻酸钠无毒，凝胶化模式温和，生物相容性良好，因此通常用于制备凝胶微球来包封细胞，可应用于细胞生物学、组织工程、药物筛选和其他生物领域。一般来说，有两种方法可以控制海藻酸钠的凝胶化过程：外部凝胶化，其中交联剂扩散到液滴外部；以及内部凝胶化，其中交联剂被加载到水相中并由刺激触发。

Liao等人使用外部凝胶化将细胞包封在生物相容性海藻酸钠液滴中，并将其包封在油滴中，形成基于双流聚焦区域的双乳液。油扩散的Ca2+进入海藻酸钠形成微凝胶。尽管这种凝胶化方法有助于保持高细胞存活率，但由于钙扩散的困难，微凝胶无法在短时间内完全凝胶化。为了解决不完全凝胶化的问题，研究人员提出了一种液滴融合方法来更好地制备单细胞微凝胶。Liu等人报道了一种基于微流控液滴技术制备单细胞微凝胶的新方法。他们使用含有2%海藻酸钠或1%氯化钙溶液的细胞悬浮液作为分散相，大豆油作为连续相，产生成对的不同液滴。两个液滴在下游相遇并融合，Ca2+使海藻酸钠凝胶化，形成包封细胞的凝胶微球。然而，由于交联发生在钙离子均匀分布之前，微凝胶的均匀性降低。此外，融合通常会导致最终交联的藻酸盐微凝胶的体积增加。

穆尼的团队开发了一种内部凝胶化方法，使用流动聚焦微流体装置制备单细胞微凝胶（图5B）。具体来说，细胞悬浮在碳酸钙纳米颗粒溶液中，这些纳米颗粒被吸附在细胞表面。在洗涤多余的纳米颗粒后，将细胞悬浮液与作为分散相的海藻酸钠溶液混合，形成油包水珠。由于油相中存在乙酸，H+扩散释放钙，钙介导海藻酸钠凝胶化形成微球。尽管这种方法可以在不进行额外下游处理的情况下显著提高单细胞包封的效率，但只有含有细胞的液滴会被交联，所得凝胶微球的结构也会不均匀。为了解决凝胶微球结构不均匀的问题，Utech等人提出了一种使用微流控液滴技术制备具有均匀结构的单分散海藻酸盐微凝胶的方法（图5C）。使用水溶性钙络合物作为交联前体，可以使钙离子在产生的海藻酸盐液滴内均匀分布。具体来说，在将单个间充质干细胞包封在液滴中后，将乙酸加入连续相中以解离复合物并释放钙离子，钙离子又与海藻酸钠反应形成结构均匀的海藻酸钠微凝胶。

琼脂糖是一种从红藻细胞壁中提取的天然线性多糖，由β-d-半乳糖和α-3,6-半乳糖苷组成。它是一种典型的天然聚合物，在37°C的溶液中由温度引发，然后在20°C下交联成凝胶。琼脂糖，特别是低熔点琼脂糖，因其良好的生物相容性和温和的凝胶化条件而适用于细胞包封实验。在他们的过程中，用低熔点琼脂糖包封单个酵母细胞以形成琼脂糖液滴，将其收集到放置在冰上的50mL离心管中以形成琼脂糖微凝胶。将琼脂糖微凝胶重新悬浮在合适的培养基中过夜培养，形成单酵母细胞集落微凝胶，这为集落深度测序提供了足够的RNA，并减少了单个单细胞基因表达谱中出现的错误。

明胶是甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸的混合物，通过皮肤、骨骼和肌腱等结缔组织中胶原蛋白的降解形成。明胶也通过温度诱导聚合形成网络结构。Li等人使用明胶作为水凝胶材料来包封微藻细胞（E.gracilis和C.reinhardtii）进行单细胞培养和筛选。基于流式细胞术辅助分选，可以选择具有快速生物量生产力或高脂质生产力的培养的微藻单克隆群体进行多重筛选。特别是，热响应性明胶可以在20-27°C的范围内维持细胞的液体培养，在4°C下发生凝胶化形成微凝胶，用于分选，当温度升高到35°C时，发生脱胶以有效恢复细胞。虽然整个过程不会对细胞造成伤害，但复杂的凝胶化机制有一定的缺点，包括凝胶化时间长，通常需要几个小时才能形成中等硬度的凝胶，导致实验效率低。为了克服这一缺点，研究人员对明胶进行了化学改性。Nan等人使用甲基丙烯酸明胶，一种光学交联明胶，可以通过紫外线照射快速凝胶化。他们的芯片上凝胶技术与微流控液滴技术无缝结合，实现了凝胶微球的高通量制备。

为了更好地模拟体内细胞的生理环境，研究人员使用多组分材料（如明胶和胶原蛋白）制备单细胞微凝胶。当单独用作支架时，胶原蛋白的机械性能较差，但添加明胶可以通过支持细胞粘附来改善凝胶的机械性能，同时保持胶原蛋白的调节性能。微凝胶的材料特性（刚度、孔径、交联度和膨胀率）可以通过改变液滴的组成和交联时间来控制。包封的细胞存活率高度依赖于交联时间，较长的交联时间会导致细胞存活率降低。交联时间为8分钟的微凝胶中约70%的细胞能够存活一周，表明凝胶珠的形成不会损伤细胞，并可能用于未来的单细胞分析。此外，微凝胶中的单细胞大多偏离中心。为了防止细胞逃逸并实现特殊的操作目的（如长期细胞培养），Kamperman等人提出了一种微流控液滴方法，通过延迟酶交联将单细胞定中心在由透明质酸和葡聚糖组成的微凝胶中。这种单细胞定心实现了细胞从微凝胶逃逸的持续预防（超过28天），大大提高了单细胞长期培养的可靠性。

免责声明:文章来源汶颢www.whchip.com以传播知识、有益学习和研究为宗旨。转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除。