原创 单细胞液滴的生物医学应用中的液滴生成

根据是否需要外力，液滴产生通常包括两种类型，即被动和主动产生微滴。被动方法不需要外力，微流控芯片结构简单。液滴的形成主要通过改变微通道结构和两相速度比来控制。主动方法通过外力产生液滴，通常具有复杂的设备几何形状。有关液滴产生的具体原理的更多信息，请参阅之前的综述。此处介绍了最近的研究报告。

被动液滴生成在被动方法中，微流体两相流由提供恒定流量的注射泵或由压力驱动泵控制，而无需额外的能量输入。在液滴形成过程中，从注射或压力驱动泵引入的一些能量被转化为界面能，这会促进液-液界面的不稳定性，使液滴能够与分散相分离。影响液滴尺寸的物理参数，如横截面形状、毛细管数和雷诺数，会影响液滴的形成过程和液滴尺寸。为了研究这些物理因素的影响，Liu等人设计了一种带有收缩微通道的T形结构，以控制单分散微滴的产生（图2A）。他们的结果表明，可以在降低流动阻力的情况下产生单尺寸的液滴。此外，他们发现收缩宽度对分散规律有显著影响，随着收缩宽度的减小，液滴尺寸趋于减小。相对于经典的T形接头通道，收缩的T形连接微通道可以产生更小的水滴，其尺寸符合应用于经典T形接头渠道的尺寸预测公式。

大多数微滴是油-水或水-油滴，通常需要使用有机试剂和表面活性剂，这限制了它们在生物和细胞研究中的广泛应用。因此，制备不含油和表面活性剂的水包水微滴更为合适。Mazutis团队提出了一种使用由葡聚糖和丙烯酸酯改性的聚乙二醇组成的双水相系统的液滴制备方法（图2B）。他们的方法用于包封革兰氏阴性和阳性细菌细胞，并测试基因组扩增反应的效率。该系统在良好的生物相容性、灵活性和高通量方面具有明显的优势，在微载体制备和组织工程等各种化学和生物应用中具有潜在的用途。然而，在被动液滴生成下封装大多数细胞的策略取决于使用具有泊松空间分布的细胞，因此，含有单个细胞的微滴数量将非常少。因此，需要进行后分离以获得含有单细胞的液滴。

近年来，多室微胶囊已被广泛应用于生物医学领域，如药物递送、癌症联合治疗、组织再生和限制性酶反应，因为它们允许多个组分被单独封装。Mou等人报道了一种基于同轴微流体装置制备均匀特洛伊木马状刺激响应微胶囊的方法（图2C）。具体来说，使用四乳液法制备均匀的O1/W2/O3/W4/O5微胶囊。每个微胶囊包含两个刺激响应性水凝胶壳，可以通过壳分解或破裂释放胶囊隔室中的内容物。制备的微胶囊可以用作控释和微反应的候选材料。此外，秦的团队设计了一种流动聚焦微流体装置，该装置通过葡聚糖和聚乙二醇从核流和壳流中自发相分离形成稳定的水-水界面，然后在油相剪切的作用下形成多室微胶囊。

主动液滴生成在主动方法中，液滴是通过主动控制在额外能量输入的帮助下生成的。与被动液滴生成相比，这种方法具有许多优点：（1）它可以灵活地控制液滴尺寸和生产频率，在某些情况下可以按需生成液滴。相比之下，在被动液滴生成中，几乎不可能独立控制液滴的大小和频率。（2）主动控制下稳定液滴生成所需的时间比被动控制下的时间短得多，产生稳定液滴的时间从被动方法下所需的几秒甚至几分钟缩短到几毫秒。（3）主动控制提高了双水相和高粘度流体中液滴形成的鲁棒性。

最近在开发主动液滴生成方法方面取得了一些进展，其中使用各种力，包括电、磁、机械、光学和声学力来操纵微流体以产生液滴。由于其快速的响应速度和与微通道结构的良好兼容性，电场被广泛应用于液滴的产生。Yin等人展示了一种通过施加直流和交流电场在微通道中精确形成尺寸可控的水包油液滴而无需表面处理的方法（图3A）。他们发现，在方波电场控制下形成的液滴尺寸与场频率呈反比线性关系，可以通过调节场的电压和频率来改变。电场方法的主要优点是其快速响应、能够精确控制液滴形成，并且不需要传统PDMS微通道中所需的表面处理，这大大降低了流体动力学特性要求，解决了液滴形成过程中材料的润湿性问题。此外，Samlali等人开发了一种基于共面电极组件的混合微流体平台，用于精确控制单细胞分离的液滴生成。遗憾的是，该系统只能实现十几个液滴/单细胞的操作，其吞吐量需要提高。

使用磁场产生液滴具有不发热、操作简单和避免与样品接触的优点。此外，温度、离子浓度和pH值等环境参数对磁场和磁力的影响很小，这为微流控液滴技术提供了新的方法。Zhang等人提出了一种在T型结微流体装置（图3B）66中使用磁场产生液滴的方法，其中永磁体放置在结的一侧以形成非均匀磁场。他们探索了两相流速和磁通密度对液滴尺寸的影响，表明它随着磁通密度的增加而增加，随着两相流比和毛细管数量的增加而减小。铁磁流体液滴的大小也可以通过改变流聚焦装置中的方波磁场来调节。利用磁力精确操纵铁磁液滴为生物、医学和精密仪器控制领域的广泛应用带来了新的前景。

通过使用机械振动器扰动分散相微管，可以实现液滴生产的机械振动。尽管大多数主动液滴生成方法需要将电极等附加组件集成到芯片中，但机械振动依赖于使用芯片外部振动器来干扰微管，从而实现简单方便的操作。Zhu等人通过测量振动引起的内部流体流动波动，定量描述了受机械振动影响的同轴聚焦微流体通道中液滴的产生（图3C）。他们发现液滴频率与振动频率同步，液滴的大小可以在很大范围内调节。由于在机械液滴产生下，液滴尺寸对微通道几何形状的依赖性非常弱，因此这种方法为克服微通道几何形状对液滴尺寸的长期限制提供了一种有效的方法。最近，秦的团队证明了气动操作是一种在水滴中可控产水的很好的方法。气动阀作用于分散相的开关周期以及分散相和连续相的流速精确地影响了其集成微流体系统中微滴的尺寸，表现出高稳定性、可控性和灵活性。

液滴也可以根据需要使用聚焦激光在光学操纵的基础上产生。正如Delville小组所报告的那样（图3D），光在空间上通过局部Marangoni应力迫使液体界面变形，并导致线到液滴的转变。最近，Wang等人使用波长为1550 nm的聚焦红外激光研究了液滴产生的控制。他们评估了在不同流速、光束功率和光斑位置下产生的激光控制液滴的特性，并比较了有和没有激光控制所需的条件。这项工作为理解红外激光控制液滴的产生及其在微流体液滴技术中的应用提供了全面的资源。

表面声波被广泛应用于按需液滴生成，因为它们具有高能量，可以限制沿基材表面传播，允许有效的流固耦合，并且清洁无污染。Jin等人报道了一种基于聚焦表面声波驱动微流体的微滴形成方法，并研究了微滴形成的相关机制和过程（图3E）。他们观察到，微滴的大小主要取决于聚焦表面声波的频率、驱动电压和分散相的速度。他们的方法克服了一般微流体液滴技术中微通道结构和毛细管数量的限制，具有高度的均匀性，同时缩短了系统响应时间。

此外，还有其他取决于离心和热效应的主动液滴生成方法。由微流体装置的旋转或使用台式微型离心分离机离心玻璃毛细管引起的离心力分别有助于T形接头或共流通道中的液滴形成。此外，电加热和冰袋辅助冷却引起的液气相变可以帮助产生尺寸相对较小的微滴，微波加热可以导致两种流体界面处拉普拉斯压力的变化，然后根据需要产生液滴。

在开发用于细胞研究的微流控液滴方法时，制造便利性、液滴生产率和生物相容性都是必须评估的关键参数。然而，鉴于对活性液滴生产方法的研究数量有限，尚不清楚哪种方法最适合细胞包封。表1中列出的活性方法都不能最佳地满足这些条件。例如，激光和高压电场的生物相容性较差，离心力驱动液滴的形成通常对细胞有害，声学、磁性和其他外部驱动方法要么涉及相对较慢的生成速率，要么涉及复杂的芯片集成。被动方法在单细胞包封率低和无法按需产生液滴方面存在缺点。然而，这些缺点只反映了当前的发展形势，并不代表固有的局限性，因为微流控液滴技术用于单细胞封装的应用仍然不发达。因此，微流控液滴技术在单细胞研究中的应用具有广阔的研究前景。

单细胞封装

单细胞分析已成为一种流行且不可或缺的策略，用于更好地探索细胞的未知特征和动力学，这些特征和动力学因类型和状态（即细胞异质性）而异，并用于更深入地了解组织、器官甚至整个生物体的行为。微液滴技术可用于产生高通量的微滴，从而可以对单细胞进行大规模的并行研究。虽然使用经典的微流控液滴方法，特别是基于被动液滴生成的方法，单细胞的包封率相对较低，但单细胞的总数和吞吐量远高于使用其他微流控单细胞操纵方法，如微孔和微图案。此外，微滴可以将单个细胞包封在纳升液滴内，这可以进一步减少物质的稀释/交叉污染/吸附，提高氧气、营养物质和代谢物的交换效率，保持细胞活性和生物功能，并促进单细胞水平的细胞研究。最后，微流控液滴技术实现了灵活的单细胞操作，并允许在单个设备中集成不同的细胞研究过程，包括细胞包封、培养、分离/分选和检测。简而言之，基于微流控液滴技术的单细胞包封的出现为单细胞分析提供了一种新方法。

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