原创 SHERLOCK试纸型检测法追踪新型冠状病毒的福尔摩斯？

 2020-3-13 12:00  8800 19 2 分类: 医疗电子文集: 知识汇集

近日新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫情持续延烧，相关各界研究更是如火如荼地进行。今（2020）年2月14日，美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）张锋等人宣布，他们与博德研究所（Broad Instituteof MIT and Harvard）、麦戈文脑科学研究所（McGovern Institute forBrain Research, MIT）等机构，将一种运用CRISPR／Cas13a、名为「SHERLOCK」的试纸型快速检测法应用在SARS-CoV-2引起的2019冠状病毒疾病（COVID-19）筛检上，并能在一小时内得知样本中是否存在病毒RNA，被视为是未来检疫的重要研究及发展方向（Zhang F et al., submitted，图一）。本文将介绍这项取名源自小说侦探人物夏洛克．福尔摩斯（Sherlock Holmes）的新兴技术。

图一：左为领导SHERLOCK 技术发展的张锋博士，右为SHERLOCK试纸。（Wikimedia; Zhang lab, Broad Institute of MIT and Harvard）

回到源头－细菌的CRISPR／Cas

想瞭解SHERLOCK的操作原理，得先知道该检测法所使用的技术──CRISPR／Cas系统。

CRISPR的全名为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（群聚且有规律间隔的短回文重複序列），是在细菌DNA中发现的一系列重複序列，可视为细菌的一种免疫机制。当细菌遭噬菌体（一种病毒）感染时，便会切取一小段噬菌体的DNA，然后储存于CRISPR之间的间隔序列（spacer），以便未来再次遭到感染时，能更快识别并摧毁同种噬菌体。而Cas指的是由CRISPR相关基因（CRISPR associated gene，简称cas基因）所编码的蛋白质酵素，会受引导RNA（guide RNA, gRNA）领导跟特定核酸序列结合，专一性相当高，功能包含解开DNA双螺旋、切割DNA和RNA分子等（图二）。科学家们利用细菌这一套独特的免疫机制，设计出一系列能修改核酸分子的工具。

图二：CRISPR的可能机制示意图。

事实上，所谓的CRISPR／Cas系统有多种形式和不同的功用。根据Nature期刊的最新文献（MakarovaKS et al., 2020），CRISPR／Cas系统可分为两大类、六型、33种亚型。其中，最为人熟知的莫过于被誉为基因神剪的「CRISPR／Cas9
（属于第二类、第二型）。而SHERLOCK这个技术的主角则是CRISPR／Cas13（属于第二类、第六型），与CRISPR／Cas9的差异在于：前者结合并切割RNA，后者则是针对DNA。

福尔摩斯登场－解决基因检测的灵敏度问题

SHERLOCK是张锋和团队在2017年4月发表于Science期刊的CRISPR检验方式，全名为Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing（特异性高灵敏度酶促报导受质解锁）（Gootenberg JS et al., 2017）。其中所用的Cas13a蛋白质（LwaCas13a）来自韦德纤毛菌（Leptotrichia wadei，暂译），具有特殊的「附带切割（collateral cleavage）性质」。从下页图三中可以看到，当Cas13a经gRNA引导跟目标RNA结合后，会无差别地切割周遭所有的RNA分子，无论它们是否为目标序列（target sequence）。

图三：Cas13a作用原理示意图：当gRNA与目标序列配对后，Cas13a蛋白质会切割附近任何RNA 分子，包含报导RNA。报导RNA 被切断后，会发出萤光。（Broad Institute of MIT and Harvard）

张锋等人利用Cas13a的这个特性，结合设计好的、针对特定病原基因体序列的gRNA，并搭配一种经特殊设计、被切割后会发出萤光的报导RNA（reporter RNA），验证了SHERLOCK能侦测病毒RNA，且灵敏度可达50飞莫耳每升（femtomolar）等级（1fM=10-15M）。儘管这样的灵敏度已较过去其它Cas13蛋白质来的高，但临床诊断应用需要达到阿莫耳每升（attomolar）等级（1 aM=10-18M），约等于每微升（μL）样本中仅含1个核酸序列分子即可被侦测）的等级。于是他们尝试结合许多不同的等温放大法（isothermal amplification），最后发现重组酶聚合酶放大（recombinase polymerase amplification, RPA）是最适合的，能够让灵敏度达到这个等级。

RPA是利用已经设计好的引子（primer）和目标序列硷基配对，再搭配重组酶以及聚合酶大量扩增原样本中的核酸含量。相较于需要反覆升温、降温的聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR），RPA可以在37~42℃间等温反应，因此不需要热循环机（thermocycler），使用上更为便捷。不过须注意的是，RPA最终产物为DNA，所以尚需经来自T7噬菌体的T7 RNA聚合酶转录成RNA，才能与Cas13a反应（图四）。

图四：SHERLOCK 的基本流程。

多种病毒检测，都难不倒它

找到最佳方法后，研究团队便合成兹卡病毒（zika virus, ZIKV）和登革热病毒（flavivirus dengue, DENV）的RNA，将它们包覆于慢病毒（lentivirus）中测试SHERLOCK。结果显示，SHERLOCK能侦测到浓度仅2阿莫耳每升的病毒RNA，且能区别过去因症状相似而常无法分明的兹卡病毒和登革热病毒。同时，SHERLOCK也能检测出病人血清、尿液或唾液中的兹卡病毒，为其未来临床应用奠下良好基础。

到了2018年4月，张锋的研究团队更进一步发表改良后的技术，结合滤纸层析（lateral flow），使未被切割的报导RNA可附著于试纸上的底线，被切割的部分则附著于试纸上方。如此一来，SHERLOCK便成为仅需将试纸浸入经RPA处理、Cas13a反应后的样本就能知道结果的试剂组，如同验孕棒一般简单，过程不须使用昂贵的设备。此外，原本一次只能针对一种目标，改良后最多可以同时侦测四种目标序列，因此能减少样本取量。该检验法除了可侦测传染性病毒，也扩展至检验致癌的基因变异、识别某些具抗生素耐药性细菌的基因等。

一小时追捕凶手－SHERLOCK三步骤检测COVID-19

不过读者应该更想知道，该试剂如何用在此疾病的筛检上吧！

目前检验冠状病毒，主要利用反转录聚合酶连锁反应（简称RTPCR），过程至少需要四小时，且仅大型医院具备相关仪器，使得医疗体系面对大量要求筛检的民众时容易无法负荷。

有鑑于上述，张锋团队试图将SHERLOCK应用于此。他们从SARS-CoV-2的基因体中，挑选了S基因和Orf1ab基因作为目标序列，并设计相对应的gRNA以及RPA所需的引子。同时，他们合成这两个基因的RNA片段，再将它做连续稀释（serial dilution）以进行后续试验。根据团队公布的操作方法（Zhang F et al., submitted），利用SHERLOCK检测COVID-19仅需三步骤。

事前准备：将检体经过核酸萃取处理（nucleic acid extraction）。此次实验并非以病人检体试验，而是以稀释的合成病毒RNA片段，所以无需萃取。

1. 等温放大（约25分钟）：利用前述的RPA法提升检体中的核酸含量。可以使用现成的RPA kit，放在42℃水浴中进行反应。
2. Cas13侦测（约30分钟）：将T7聚合酶、gRNA、LwaCas13a蛋白质和报导RNA放入第一步处理完的溶液中。均匀混合后，置于37℃水浴。
3. 试纸读取（约2分钟）：用缓衝溶液稀释反应完的溶液，插入专用试纸读取结果。

结果分析：试纸底部的控制组底线（control band）应该都要呈色。若有侦测到病毒RNA，则会出现两条线。从图五可知，如果检体对于S基因和Orf1ab基因皆呈现两条线，则代表COVID-19阳性（positive）。

图五：SHERLOCK 试剂组测试COVID-19之结果示意图。

虽然此实验证明出SHERLOCK能应用于筛检COVID-19，但研究团队仍强调，这项初始试验并非在患者样本上测试，尚待后续更进一步地改良。他们声明，任何检验组都需经过完整临床阶段的开发、确效，并遵守相关法规。

故事才刚开始－SHERLOCK的未来及挑战

SHERLOCK相较于传统的RTPCR在操作上更为简单、迅速，完全不需要複杂的仪器。若能顺利发展，可以让一般诊所即能对COVID-19、登革热等传染病进行检测，减轻大型医院的负担，甚至还可以携带至医疗资源较匮乏的地区协助控制疫情，如检疫非洲的伊波拉病毒。

然而，由于SHERLOCK所需的报导RNA及Cas13蛋白价格仍然偏高，如何便宜地大量生产是相当大的挑战，而成败的关键或许在于：能否使用最少的原料达到足够的灵敏度及精准度，进而压低成本。此外，如果要到偏远地区进行检疫，如何确保蛋白质及相关试剂在运送过程中不会变质，也会是一大考验。同时须注意到，若在非最适反应温度的条件下，RPA是否能维持其专一性？所设计的gRNA是否提供足够的特异性？所使用的Cas13a是否提供足够的精准度而不致有脱靶效应（off-target effect）、造成伪阳性（false positive）的检测结果？这些考量都需要未来以更严密的临床试验才能进一步确认。

儘管如此，SHERLOCK仍是发展防疫工具的良好研究方向。张锋的团队欢迎各界学者与他们联繫以寻求协助和指导，并愿意提供初学者试剂套组（starter kit）以利各方进行测试。期待不久后SHERLOCK能如其名，成为调查基因和病毒序列的大侦探！

参考资料
1. Zhang F, Abudayyeh OO, Gootenberg JS, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics (submitted, 2020).
2. KS Makarova, YI Wolf, J Iranzo et al., Evolutionary classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants, Nature Reviews Microbiology, Vol 18: 67-83, 2020.
3. Gootenberg JS et al., Nucleic acid detection withCRISPR/Cas13a/C2C12, Science, Vol 356: 438-442, 2017.

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