一、扫描电镜原理
自从1965年第一台商品扫描电镜问世以来，经过40多年的不断改进，扫描电镜的分辨率从第一台的25nm提高到现在的0.01nm，而且大多数扫描电镜都能与X射线波谱仪、X射线能谱仪等组合，成为一种对表面微观世界能够经行全面分析的多功能电子显微仪器。
在材料领域中，扫描电镜技术发挥着极其重要的作用，被广泛应用于各种材料的形态结构、界面状况、损伤机制及材料性能预测等方面的研究。利用扫描电镜可以直接研究晶体缺陷及其产生过程，可以观察金属材料内部原子的集结方式和它们的真实边界，也可以观察在不同条件下边界移动的方式，还可以检查晶体在表面机械加工中引起的损伤和辐射损伤等。
二、扫描电镜的结构及主要性能
扫描电镜可粗略分为镜体和电源电路系统两部分。镜体部分由电子光学系统、信号收集和显示系统以及真空抽气系统组成。
图1 扫描电镜结构示意图
1 电子光学系统
由电子枪，电磁透镜，扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。
2 信号收集及显示系统
检测样品在入射电子作用下产生的物理信号，然后经视频放大作为显像系统的调制信号。现在普遍使用的是电子检测器，它由闪烁体，光导管和光电倍增器所组成。
3 真空系统
真空系统的作用是为保证电子光学系统正常工作，防止样品污染，一般情况下要求保持10-4~10-5Torr的真空度。
4 电源系统
电源系统由稳压，稳流及相应的安全保护电路所组成，其作用是提供扫描电镜各部分所需的电源。
5 各类显微镜主要性能的比较
表1 各类显微镜性能的比较
三、扫描电镜工作原理
图2 扫描电镜原理图
扫描电镜由电子枪发射出来的电子束，在加速电压的作用下，经过磁透镜系统汇聚，形成直径为5nm，经过二至三个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成一个细的电子束聚焦在样品表面。在末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下使电子束在样品表面扫描。由于高能电子束与样品物质的交互作用，结果产生了各种信息：二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和透射电子等。这些信号被相应的接收器接收，经放大后送到显像管的栅极上，调制显像管的亮度。由于经过扫描线圈上的电流是与显像管相应的亮度一一对应，也就是说，电子束打到样品上一点时，在显像管荧光屏上就出现一个亮点。扫描电镜就是这样采用逐点成像的方法，把样品表面不同的特征，按顺序，成比例地转换为视频信号，完成一帧图像，从而使我们在荧光屏上观察到样品表面的各种特征图像。
1 扫描电镜衬度像
㈠ 二次电子像
在入射电子束作用下被轰击出来并离开样品表面的核外电子叫做二次电子。这是一种真空中的自由电子。二次电子一般都是在表层5~10 nm深度范围内发射出来的，它对样品的表面形貌十分敏感，因此，能非常有效地显示样品的表面形貌。二次电子的产额和原子序数之间没有明显的依赖关系，所以不能用它来进行成分分析。
3.1.2 背散射电子像
背散射电子是被固体样品中的原子核反弹回来的一部分入射电子，背散射电子来自样品表层几百纳米的深度范围。由于它的产能随样品原子序数增大而增多，所以不仅能用作形貌分析，而且可以用来显示原子序数衬度，定性地用作成分分析。 背散射电子信号强度要比二次电子低的多，所以粗糙表面的原子序数衬度往往被形貌衬度所掩盖。
㈡ 扫描电镜的附件
扫描电镜一般都配有波谱仪或者能谱仪。波谱仪和能谱仪是不能互相取代的，只能是互相补充。 波谱仪是利用布拉格方程2dsinθ=λ，从试样激发出了X射线经适当的晶体分光，波长不同的特征X射线将有不同的衍射角2θ。波谱仪是微区成分分析的有力工具。波谱仪的波长分辨率是很高的，但是由于X射线的利用率很低，所以它使用范围有限。 能谱仪是利用X光量子的能量不同来进行元素分析的方法，对于某一种元素的X光量子从主量子数为n1的层跃迁到主量子数为n2的层上时，有特定的能量ΔE=En1-En2。能谱仪的分辨率高，分析速度快，但分辨本领差，经常有谱线重叠现象，而且对于低含量的元素分析准确度很差。
能谱仪与波谱仪相比的优缺点：
（1） 、能谱仪探测X射线的效率高。
（2）、 能谱仪的结构比波谱仪简单，没有机械传动部分，因此稳定性和重复性都很好。
（3） 、能谱仪不必聚焦，因此对样品表面没有特殊要求。 但是能谱仪的分辨率比波谱仪低；能谱仪的探头必须保持在低温状态，因此必须时时用液氮冷却。
四、扫描电镜在材料学中的应用
1 试样制备技术
和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。在保持材料原始形状情况下，可以直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），这是扫描电镜的一个突出优点。扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。
扫描电镜的特点是：
① 、观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。
② 、试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。
③ 、试样表面一般起伏（凹凸）较大。
④ 、观察方式不同，制样方法有明显区别。
⑤ 、试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。
上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。
扫描电镜块状样品的制备：
1、导电性材料
导电材料主要指金属，一些矿物和半导体材料也有一定的导电性这种材料的样品制备是最简单的只要样品尺寸不超过SEM的要求（例如，样品的最大直径为pH25mm，最大厚度为20mm等），然后用双面胶带粘贴在托盘上，然后用导电银浆将样品与托盘连接（以确保良好的导电性），并等待银浆。晾干（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银膏没有完全晾干，抽真空时会不断挥发蒸金，之后可以在扫描电镜中直接观察到但在样品制备过程中，也应注意：
①为了减少扫描电镜的污染，保持良好的真空度，样品尺寸应尽可能小
②在切割样品时，避免样品在加热过程中产生的塑性变形或观察表面上氧化层的形成。防止机械损坏或水、油、灰尘和其他污染物进入
③当观察表面，特别是各断口间隙有污染物时，可用无水乙醇、丙酮或超声波清洗这些污染物都是隐藏图像细节，造成样品收费和图像质量恶化的原因
④故障部件或电接触断裂处的油污、氧化层和腐蚀产物不易清除。观察这些物质往往有助于分析故障的原因如果确认这些异物是故障后引入的，一般可以用塑料胶胶带或醋酸纤维素薄膜粘贴几次，然后用有机溶剂清洗去除
③SEM样品表面的氧化层一般难以去除。必要时，可采用化学法或阴极电解法使试样表面基本恢复原状
为了同时观察多个样品，通常是同一类型的样品，并在扫描电子镜中快速找到所需的样品，通常在1号样品的胶带上剪一个角，然后按逆时针顺序放置样品（观察时也按逆时针顺序放置）
2、非导电性材料
用于扫描电镜的非导电块体材料样品的制备也相对简单，基本上可以与导电块体材料样品的制备相同，但需要注意的是，在涂覆导电银浆时，必须从托盘连接到块体材料样品的上表面因为在观察过程中电子束直接照射在样品的上表面
扫描电镜块状样品的制备：
首先在扫描电镜的载盘上粘上贴双面胶带，然后在载盘中心附近的胶带上取少量粉末样品，然后用橡皮球向载盘径向向外轻轻吹（注意不要用嘴吹，以免唾液粘在样品上或用工具拉粉，以免损伤试样表面形貌），使粉均匀地分布在胶带上，也可将粘结不牢的粉吹走（以免污染镜体）
然后在胶带边缘涂上导电银膏，将样品与托盘连接起来银浆干燥后，可以进行最终的金蒸发处理（注：导电和非导电粉末样品都必须进行金蒸发处理，因为即使样品是导电的，在粉末状态下，颗粒之间紧密接触的概率也很小除非使用更昂贵的碳导电双面胶）
扫描电镜溶液样品的制备：
扫描电镜溶液样品一般采用薄铜带作为载体首先在扫描电镜载物盘上粘上贴双面胶，然后贴上干净的薄铜带，然后小心地将溶液滴在铜带上，待其干燥（一般用灯近距离照射10分钟），然后观察样品量是否足够如果不够，再滴一次，再涂导电银膏，干燥后蒸金。
扫描电镜生物样品的制备：
扫描电镜在观察生物样品时，具有以下特点：多角度观察样品的表面结构；不需要将样品切成薄片；景深大、图像立体感强；放大倍数从几十倍到几十万倍连续可调；在观察形貌的同时可以对微区的成分进行定量和定性分析。而能否获得真实、清晰、理想的扫描电镜观察结果，样品的制备过程是关键。
生物样品含水直接观察，会对扫描电镜造成以下影响：
1. 样品蒸发的水蒸气遭遇高能电子束，会被电离而放电，引起束流大幅度波动，使图像模糊，或者根本不能成像;
2. 大多数含水样品在高真空中容易发生形态损伤，表面皱缩、变形;
3. 样品挥发会造成镜头、光阑等的污染;
4. 灯丝会被上升水蒸气氧化而变质。
2. 大多数含水样品在高真空中容易发生形态损伤，表面皱缩、变形;
3. 样品挥发会造成镜头、光阑等的污染;
4. 灯丝会被上升水蒸气氧化而变质。
生物样品的含水量高，二次电子产率低，导电性差，对热，电子束敏感，仅有少数样品如毛发、牙齿以及含水量极低的昆虫等可以直接喷镀观察，绝大多数的生物样品均要求经过干燥处理才能镀金观察。
干燥是扫描电镜生物样品制备中的关键环节，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度。要想制备出好的扫描电镜生物样品，需要在干燥过程中尽可能减少由于水分蒸发而引起的样品表面形貌的形变，且必须确保干燥彻底。大多数动植物容易发生明显的塌陷和变形。因此，需要针对不同的生物样品来选择合适的干燥方法。
扫描电镜溶液样品的制备：
扫描电镜生物样品制备常用干燥方法
1. 自然干燥法
自然干燥法是指样品中的水分在大气中自然蒸发，或样品经脱水处理后脱水剂自然挥发而干燥的方法。
对干种子、果壳、某些干花粉、昆虫标本等来说，自然干燥法是一个简易实用有效的方法，虽然在自然干燥过程中，样品体积有所收缩，但却保留了样品的基本形态。适用于外表坚硬的样品，如外表有壳的昆虫，木材等。
自然风干——电镜直接观察螨虫
2. 烘干干燥法
烘干干燥法是将要研究的样品用烘干箱烘干，一般温度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下为好。此方法的干燥速度较快，但水分蒸发时可能造成样品变形或断裂。适用于不易变形且耐热的样品，比如淀粉粒、孢子粉等。
烘干的花粉喷金后直接可以用二次电子观察
3. 临界点干燥法
临界点干燥法是利用物质在临界状态下，液体和气体的密度相等，气液界面完全消失，液体的表面张力系数为零。临界点干燥法之所以一直被视为制作生物医学扫描样品最可靠的干燥方法，是因为此法能消除液体表面张力的作用，干燥出的样品能最大程度地保存其自然形态。
4. 冷冻干燥法
冷冻干燥法是将含水样品放入低温环境中冷冻，或使用溶剂将样品中的水逐级替换后冷冻，然后抽真空升华。它是利用低温和真空，使样品中的水分或溶剂直接升华，以达到干燥样品的目的。冷冻干燥过程不经过液相阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤。
5. 真空干燥法
真空干燥法指的是将经脱水（多用梯度脱水）的样品置于真空容器中进行干燥的方法。真空干燥法选用高熔点的有机溶剂（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升华介质，既保留了冷冻干燥法的优点，又不用对样品进行冷冻处理，无冷冻损伤，且操作简单。适用于所有生物样品，特别是细菌、细胞等微小样品。
经过梯度脱水真空干燥的杆菌可以轻松获得高倍图像
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